基于巨噬细胞极化探究唾液酸转移酶Ⅰ（ST6GalⅠ）对肾透明细胞癌生长及免疫功能的影响①

李前进 王玉杰 刘 强 马双钰 拜合提亚·阿扎提

（新疆医科大学第一附属医院泌尿外科，乌鲁木齐 830054）

肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是全球第二位高病死率的泌尿系统恶性肿瘤，起源于肾小管上皮细胞［1］。近年来，RCC的发病率呈增长趋势［1-2］。肾透明细胞癌是常见的RCC组织学类型，占所有RCC病例的80%以上，并且具有高转移和高复发的特点［2］。越来越多的证据表明，肾透明细胞癌可以在早期阶段治愈，而发生肿瘤转移的患者预后不良，五年生存率仅为10%［3］。因此，迫切需要探索肾透明细胞癌发生和转移的分子机制，寻找肾透明细胞癌的新预后生物标志物。

唾液酸化是在各种糖缀合物的末端添加唾液酸的修饰作用，涉及细胞黏附、信号转导、免疫调节等重要生物学过程［4］。α-2，6-唾液酸转移酶Ⅰ（α-2，6-sialyltransferaseⅠ，ST6GalⅠ）是一种糖基转移酶，在细胞唾液酸化的水平中起到关键的调控作用。研究表明，肿瘤的发生发展及存活与ST6GalⅠ的异常变化密切相关，例如在结直肠癌、乳腺癌、胃癌等肿瘤细胞中ST6GalⅠ呈高表达［5-7］。巨噬细胞是免疫系统中的主要细胞类型，可响应各种外部刺激而被激活，可以根据系统中刺激类型产生炎症或抗炎反应，因此该过程依赖于多种信号通路的复杂网络系统调控来发挥作用［8］。本研究通过检测ST6GalⅠ在肾透明细胞癌中的表达，探讨靶向下调ST6GalⅠ表达THP-1细胞与肾透明细胞癌786-O细胞进行非接触共培养后，对786-O细胞存活、凋亡与转移的影响，以阐明ST6GalⅠ在肾透明细胞癌生长中的作用途径，为肾透明细胞癌的诊治提供新思路。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 收集2018年1月至2019年12月在新疆医科大学第一附属医院肿瘤科治疗的50例肾透明细胞癌患者的肿瘤组织及其未受侵犯的癌旁组织标本，且已经病理证实。其中男性36例，女性14例，年龄31～72岁，平均年龄（50.62±7.36）岁。肿瘤分期根据2010年AJCC的TNM分期标准分为：Ⅰ期21例，Ⅱ期17例，Ⅲ期12例；病理分级按Fuhrman标准分为：Ⅰ级19例，Ⅱ级17例，Ⅲ级11例，Ⅳ级3例；按肿瘤直径大小分为：直径≤4 cm 22例，直径＞4 cm 28例。所有患者术前均未接受过任何治疗，本研究已获得所有患者及家属知情同意。

1.1.2 主要材料与试剂 肾透明细胞癌细胞株786-O和THP-1人单核细胞由中国上海科学院细胞库提供。胎牛血清、青霉素-链霉素、RPMI1640培养液购自Hyclone公司，PMA、IL-4购自Sigma公司；TRIzol试剂、反转录试剂盒和SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒购自TaKaRa公司；Transwell小室、Lipofectamine 2000试剂盒购自Invitrogen公司；免疫组化染色试剂、MTT试剂盒、Annexin V-FITC/PI试剂盒购自碧云天生物研究所；IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β1 ELISA试剂盒购自北京全式金生物公司；抗体ST6GalⅠ、CD206、TIM-1、VEGF购自Abcam公司；GAPDH购自北京中山金桥生物技术有限公司；BCA蛋白检测试剂盒和ECL发光液购自江苏凯基生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色 将收集的肾透明细胞癌肿瘤组织及其癌旁组织置于4%多聚甲醛液中固定，进行常规修剪包埋，浸于梯度乙醇脱水，二甲苯中透明，切成4µm石蜡组织切片。将切片脱蜡水化，采用2%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液在高温下进行抗原修复，加入灭活内源性3%H2O2处理10 min，PBS洗涤，滴加ST6GalⅠ抗体（1∶200），4℃下孵育过夜。次日，PBS冲洗切片，再加入二抗（1∶1 000）置于室温下孵育1 h，PBS冲洗干净，滴加DAB染核5 min，苏木精复染，脱水透明，采用中性树胶封片，于电镜下进行观察。

结果判定：阳性表现为染色呈黄色、棕黄色至棕褐色，随机观察6个400倍镜视野，以阳性细胞比例及染色强度进行综合评定。染色强度无色计0分；浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。阳性细胞比例＜5%计为0分，5%～30%计为1分，31%～60%计为2分，＞60%计为3分。判定结束后将染色强度与阳性细胞比例的评分相乘，＜2分判定为阴性（-）结果，≥2分判定为阳性（+）结果。

1.2.2 实时荧光定量PCR 使用TRIzol试剂提取肿瘤组织、癌旁组织及各处理细胞中提取总RNA，紫外分光光度计检测RNA纯度、浓度，按照反转录试剂盒说明书进行操作合成cDNA，以此cDNA为模板，利用SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒进行定量，检测各基因mRNA表达，以GAPDH作为内参基因。扩增条件设置为：95℃3 min，1个循环；95℃30 s、60℃30 s、58℃30 s，40个循环，根据2-ΔΔCt法计算基因mRNA相对表达量。引物由上海生工生物有限公司合成，具体序列见表1。

1.2.3 细胞培养与转染 将THP-1细胞放在含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗的RPMI-1640培养液中培养，且置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中。取对数生长期的THP-1细胞，调整细胞密度为1×106个/ml，吸取100µl接种于6孔培养板，并铺板于不含抗生素的Opti-MEM中培养，当细胞融合达80%时，利用脂质体Lipofectamine2000进行转染，实验设对照组（正常培养）、siRNA-NC组（转染阴性对照siRNA-NC质粒）和siRNA-ST6GalⅠ组（转染siRNA-ST6GalⅠ质粒），根据试剂盒说明书操作，将转染试剂加入细胞后，在细胞培养箱中孵育6 h，弃培养液，更换为新鲜培养液继续培养，48 h后收集细胞。采用实时荧光定量PCR与Western blot实验检测各组THP-1细胞中ST6GalⅠmRNA与蛋白表达变化，以评估转染结果。

1.2.4 诱导THP-1细胞分化 取转染后生长状态良好的THP-1细胞，调整密度为1×106个/ml，吸取100µl接种于6孔培养板，加入终浓度为50 ng/ml的PMA诱导24 h，弃培养液，PBS清洗后，加入终浓度为20 ng/ml的IL-4诱导48 h，以不进行诱导处理的THP-1细胞作为对照组。采用实时荧光定量PCR检测巨噬细胞相关标志物Arg-1和iNOS蛋白的表达，检测各处理组THP-1细胞极化情况。

1.2.5 流式细胞术检测巨噬细胞表面标记物表达 收集诱导后的细胞，采用PBS洗涤并重悬细胞，取适量细胞悬液，并加入等体积的小鼠血清，置于室温下封闭30 min，去除非特异性结合，加入PECD206抗体，置于4℃暗室中反应30 min，PBS洗涤细胞后将其再次重悬，通过流式细胞仪检测细胞表面巨噬细胞标记物的表达。

1.2.6 巨噬细胞与786-O细胞共培养 在24孔Transwell小室的上室接种转染后的THP-1细胞，密度为1×104个/孔，按照1.2.4的方法进行诱导，诱导完成前1 d，在Transwell小室的下室均接种786-O细胞，密度为1×104个/孔，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。共培养72 h后收集下室中的786-O细胞，进行后续实验研究。实验分组具体设置为786-O组（上室：细胞培养液，下室：786-O细胞）、M2+786-O组（上室：对THP-1细胞进行诱导处理，下室：786-O细胞）、M2+NC 786-O组（上室：对转染siRNA-NC质粒的THP-1细胞进行诱导处理，下室：786-O细胞）、M2+ST6GalⅠ786-O组（上室：对转染siRNA-ST6GalⅠ质粒的THP-1细胞进行诱导处理，下室：786-O细胞）。

1.2.7 MTT法检测细胞增殖 收集处理72 h后的786-O细胞，PBS洗涤细胞，每孔加入500µl用无血清培养基稀释的MTT试剂（0.5 mg/ml）混合均匀，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱培养，4 h后弃去培养液，加入600µl DMSO，摇床振荡至结晶物完全溶解，通过酶标仪检测490 nm处吸光度值（A值），检测细胞存活情况。

1.2.8 细胞划痕实验检测细胞迁移 收集处理72 h后的786-O细胞，在6孔培养板大约每隔0.5 cm划一道横线，然后在每孔中加入5×105个各处理组的786-O细胞，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中过夜培养。次日，利用移液枪枪头比对直尺，沿着垂直于细胞培养孔背后横线划痕，采用PBS洗去划痕下的细胞，加入无血清RPMI1640培养基，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱继续培养，分别于0 h、24 h取样观察各处理组细胞划痕愈合情况。

1.2.9 流式细胞术检测细胞凋亡 收集处理72 h后的786-O细胞，消化离心，制成细胞悬液，根据Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒进行操作，检测各处理组细胞凋亡情况。在细胞中加入500µl

1×binding buffer轻轻混匀，得到细胞悬液，在细胞悬浮液加入5µl Annexin V-FITC和10µl PI，混匀后，置于室温下避光孵育15 min，采用流式细胞仪检测各处理组细胞凋亡情况。

1.2.10 Western blot 在各处理组细胞中加入RIPA裂解液裂解并离心取上清液，BCA试剂盒检测蛋白质量，取各组等量蛋白样品上样，经过10%SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜，TBST缓冲液洗膜，加入5%脱脂奶粉液，室温下封闭1 h。然后加入稀释 的 一抗ST6GalⅠ（1∶1 000）、TIM-1（1∶1 000）、VEGF（1∶1 000），以GAPDH（1∶1 000）作为内参蛋白，4℃下孵育过夜。次日，TBST缓冲液清洗后，滴加对应的二抗，置于室温下继续孵育2 h，TBST缓冲液再次洗膜，ECL发光液曝光，Image J软件检测各蛋白条带灰度值。

1.2.11 ELISA检测 786-O细胞经过不同处理后培养72 h，收集各处理组细胞培养上清，ELISA检测培养上清中细胞炎症因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β1的含量，实验步骤严格按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.3 统计学分析 SPSS23.0统计学软件进行数据分析，计量资料均采用±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾透明细胞癌组织及癌旁组织中ST6GalⅠ表达比较 免疫组化染色结果显示，在肾透明细胞癌组织中ST6GalⅠ阳性表达率为84.0%（42/50）；在癌旁组织中，ST6GalⅠ阳性表达率为14.0%（7/50）。与癌旁正常组织比较，肾透明细胞癌组织中ST6GalⅠ阳性表达率明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01，图1A）。实时荧光定量PCR检测肾透明细胞癌组织与癌旁组织中ST6GalⅠmRNA表达水平，结果显示，肾透明细胞癌组织中ST6GalⅠmRNA相对表达量明显高于癌旁组织中ST6GalⅠmRNA相对表达量（P＜0.01，图1B）。

2.2 转染后THP-1细胞中ST6GalⅠ表达检测 通过实时荧光定量PCR和Western blot检测各组THP-1细胞中ST6GalⅠmRNA和蛋白表达水平，检测结果显示，与对照组比较，siRNA-ST6GalⅠ组细胞中ST6GalⅠmRNA和蛋白相对表达量均显著下降（P＜0.05），而siRNA-NC组和对照组ST6GalⅠmRNA和蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05），表明转染成功，见图2。

图2 转染后THP-1细胞中ST6GalⅠmRNA和蛋白表达检测Fig.2 Detection of ST6GalⅠmRNA and protein expressionsin THP-1 cells after transfection

2.3 诱导后THP-1细胞形态及巨噬细胞相关标记物表达变化 通过倒置相差显微镜观察各组细胞形态，如图3A所示，THP-1细胞边缘清晰，呈规则的圆形或类圆形。经诱导后，细胞形态发生明显改变，呈不规则的多边形，胞体伸出尾足。

实时荧光定量PCR检测结果显示，与对照组比较，PMA+IL-4诱导后，细胞中Arg-1 mRNA表达显著升高，iNOS mRNA表达显著下降（P＜0.05）；与PMA+IL-4组比较，转染siRNA-ST6GalⅠ后进行诱导处理的细胞Arg-1 mRNA表达显著下降，iNOS mRNA表达显著升高（P＜0.05，图3B）。

图3 诱导后THP-1细胞形态变化及巨噬细胞相关标志物表达检测Fig.3 Morphological changes of THP-1 cells and expression of macrophages related markers after induction

流式细胞术检测结果表明，与对照组比较，PMA+IL-4诱导后细胞中M2型巨噬细胞表面标志物CD206的表达显著升高（P＜0.05）；与PMA+IL-4组比较，转染siRNA-ST6GalⅠ后进行诱导处理的细胞中CD206表达显著下降（P＜0.05），见图4。以上结果均说明下调ST6GalⅠ可抑制IL-4诱导巨噬细胞向M2型极化。

图4 流式细胞术检测M 2型巨噬细胞标志物CD206表达Fig.4 Flow cytometry to detect expression of M 2 macrophage marker CD206

2.4 下调ST6GalⅠ表达的巨噬细胞对786-O细胞存活率的影响 MTT检测结果显示，与786-O组比较，M2+786-O组786-O细胞的存活率显著升高（P＜0.05）；M2+ST6GalⅠ786-O组细胞存活率较M2+786-O组则显著下降（P＜0.05），而M2+NC786-O组与M2+786-O组的细胞存活率差异无统计学意义（P＞0.05），见图5。

图5 MTT法检测各处理组786-O细胞存活率Fig.5 MTT method to detect survival rate of 786-O cells in each treatment group

2.5 下调ST6GalⅠ表达的巨噬细胞对786-O细胞迁移的影响 细胞划痕实验结果如图6所示，细胞培养24 h后，与786-O组比较，M2+786-O组786-O细胞划痕面积减小，划痕愈合率显著升高（P＜0.05）；与M2+786-O组比较，M2+ST6GalⅠ786-O组划痕面积增加，划痕愈合率显著降低（P＜0.05），M2+NC 786-O组与M2+786-O组的细胞划痕愈合率差异无统计学意义（P＞0.05）。

图6 细胞划痕实验检测各处理组786-O细胞迁移Fig.6 Cell scratch test to detect migration of 786-O cells in each treatment group

2.6 下调ST6GalⅠ表达的巨噬细胞对786-O细胞凋亡的影响 流式细胞术检测结果显示，M2+786-O组786-O细胞凋亡率与786-O组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；而与M2+786-O组比较，M2+ST6GalⅠ786-O组细胞凋亡率显著增加（P＜0.05），M2+NC 786-O组与M2+786-O组的细胞凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05），见图7。

图7 流式细胞术检测各处理组786-O细胞凋亡Fig.7 Flow cytometry to detect 786-O cell apoptosis in each treatment group

2.7 下调ST6GalⅠ表达的巨噬细胞对786-O细胞上清液炎症因子分泌的影响 ELISA检测结果显示，与786-O组比较，M2+786-O组细胞上清液中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量显著下降，抑炎因子IL-10、TGF-β1含量显著升高（P＜0.05）；与M2+786-O组比较，M2+ST6GalⅠ786-O组细胞上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量显著升高，同时，IL-10、TGF-β1含量显著下降（P＜0.05），而M2+NC 786-O组与M2+786-O组细胞上清液中各因子含量差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 各处理组786-O细胞上清中炎症因子含量比较（±s，ng/L）Tab.2 Comparison of inflammatory factors in supernatant of 786-O cells in each treatment group（±s，ng/L）

表2 各处理组786-O细胞上清中炎症因子含量比较（±s，ng/L）Tab.2 Comparison of inflammatory factors in supernatant of 786-O cells in each treatment group（±s，ng/L）

Note：1）P＜0.05 vs786-Ogroup；2）P＜0.05 vs M2+786-Ogroup.

Groups 786-O M2+786-O M2+NC 786-O M2+ST6GalⅠ786-O F P IL-1β 32.13±3.08 20.82±1.761）21.45±1.80 27.82±2.332）220.03 0.000 IL-6 26.53±1.67 12.82±1.711）11.92±0.84 22.67±1.862）318.98 0.000 IL-10 8.24±1.58 24.19±1.591）22.80±1.72 12.35±1.052）288.67 0.000 TNF-α 56.75±5.57 24.47±1.591）25.01±1.45 42.82±3.722）109.12 0.000 TGF-β1 358.65±27.89 560.23±44.341）557.38±38.56 416.38±31.952）1052.09 0.000

2.8 下调ST6GalⅠ表达的巨噬细胞对786-O细胞中免疫相关蛋白表达的影响 Western blot检测各处理组786-O细胞中TIM-1、VEGF蛋白表达情况，结果显示，与786-O组比较，M2+786-O组细胞中TIM-1蛋白表达下降，VEGF蛋白表达升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与M2+786-O组比较，M2+ST6GalⅠ786-O组TIM-1蛋白表达升高，而VEGF蛋白表达下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）；M2+NC 786-O组与M2+786-O组两个蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05），见图8。

图8 Western blot检测各处理组786-O细胞中TIM-1、VEGF蛋白表达Fig.8 Western blot detection of TIM-1 and VEGF protein expressions in 786-O cells in each treatment group

3 讨论

肾透明细胞癌是一种高度侵入性的泌尿外科恶性肿瘤，对于局部性肾透明细胞癌可以通过手术切除与放化疗等手段进行治疗，而这些常规的治疗方法对于转移性肾透明细胞癌的治疗效果不佳，治疗后复发率高，这也是RCC相关死亡的主要原因［3］。尽管在过去几十年中，关于转移性肾透明细胞癌的治疗研究取得了显著进展，靶向酪氨酸激酶抑制剂或免疫疗法已得到了批准。但，参与肾透明细胞癌进展的潜在靶标以及确切的分子机制仍不清楚，需要进一步深入探讨以发掘诊治肾透明细胞癌的新策略。

蛋白质糖基化是一个复杂的翻译后修饰过程，涉及将糖基部分转移到蛋白质的特定氨基酸残基上，通过糖基转移酶（GTs）形成糖苷键。在各种糖基化类型中，唾液酸化能够将唾液酸加到糖蛋白或糖脂上聚糖链的末端，唾液酸参与信号识别、神经发育、免疫反应、肿瘤转移等多种生物学过程［9］。一般而言，细胞中唾液酸水平的平衡由两组酶调节，即唾液酸转移酶和唾液酸酶。目前的研究已经揭示ST6GalⅠ水平异常与多种疾病有关，如微生物感染、神经系统疾病和癌症。WATTANAVISES等［10］研究报道指出胆管癌中ST3GalI和ST6GalⅠ的水平上调，且ST6GalⅠ与患者生存期密切相关；WICHERT等［11］研究分析了ST6GalⅠ在预测卵巢癌预后中的作用，表明ST6GalⅠmRNA高水平表达与淋巴管浸润有关，而ST6GalⅠ蛋白高水平表达与远处转移和晚期阶段相关；SCHULTZ等［12］研究发现在卵巢癌细胞系OVCAR3中过表达ST6GAL1后，肿瘤细胞呈较高的存活力和迁移能力，并且降低的Caspase-3活化从而抑制了细胞的凋亡，从而表明ST6GalⅠ诱导的唾液酸化可能对卵巢癌细胞具有保护作用。本研究结果显示，ST6GalⅠ在肾透明细胞癌组织中呈现高表达，由此推测ST6GalⅠ参与了肿瘤细胞的发生发展。

迁移和细胞死亡导致机体内常驻巨噬细胞数量减少时，生长因子和促炎细胞因子的刺激使血液中单核细胞分化为巨噬细胞并迁移到组织中以维持免疫系统稳态，并通过吞噬作用，抗原呈递确保适当的炎症反应和细胞因子的产生［13］。因此，单核细胞向巨噬细胞的分化是生物过程的重要组成部分。在体外实验中，THP-1巨噬细胞由于具有稳定的敏感性与均一遗传的背景而常用于各项研究［14］。作为肿瘤微环境中重要的免疫细胞，巨噬细胞受多种趋化因子的影响可分化为M1型和M2型。M1型巨噬细胞响应IFN、Toll样受体配体、病原体相关分子复合物的作用而极化，分泌IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子。M2型巨噬细胞因子IL-4和IL-13诱导所激活，并分泌IL-10和TGF-β等抗炎因子［15-16］。本实验选取肾透明细胞癌786-O细胞和THP-1源巨噬细胞共培养构建肾透明细胞癌相关巨噬细胞模型，验证ST6GalⅠ在巨噬细胞上的表达对肾透明细胞癌的作用，发现下调ST6GalⅠ的THP-1细胞经诱导后再与肾透明细胞癌细胞共培养，对肾透明细胞癌细胞具有抑制作用，促进肿瘤细胞的凋亡并减少其迁移。此外，本研究发现抑制ST6GalⅠ表达可逆转巨噬细胞向M2型极化，由此推测ST6GalⅠ可能通过调控巨噬细胞极化参与肾透明细胞癌的进程。

慢性炎症和免疫反应是肿瘤微环境的两个核心要素。肿瘤微环境中存在大量的免疫/炎症细胞，包括肿瘤相关的巨噬细胞、嗜中性粒细胞和髓样来源抑制性细胞，以及细胞因子如IL-6、IL-10、TGF-β等，这种既有慢性炎症状态又有免疫抑制的作用共同调节了肿瘤细胞迁移、侵袭、转移和抗癌药物的敏感性［17］。一方面，分泌的细胞因子改变了细胞毒性T淋巴细胞和抗原呈递细胞的功能，从而抑制了肿瘤特异性的免疫反应，从而为肿瘤细胞诱导了特殊的免疫抑制性微环境；另一方面，肿瘤细胞通过相关信号通路改变了肿瘤微环境中免疫/炎症细胞的分化和功能，促进肿瘤细胞的增殖［18］。研究表明，在一些因素的影响下，可降低肿瘤的免疫抑制引发肿瘤细胞的免疫原性死亡。而肿瘤微环境中分泌的免疫抑制因子，如VEGF是引起肿瘤免疫逃逸的一个主要原因，而TIM-1可调节多种效应性T细胞的表达，影响Th1/Th2细胞平衡［19］。本研究结果显示，下调ST6GalⅠ的THP-1细胞经诱导后，肿瘤细胞培养液上清中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量升高，同时，TIM-1蛋白表达升高而VEGF蛋白表达下降，由此推测ST6GalⅠ可能与肾透明细胞癌细胞免疫相关分子表达相关，进而参与调控肿瘤细胞免疫功能。

综上所述，ST6GalⅠ促使肾透明细胞癌恶化的途径可能是通过促进巨噬细胞向M2型极化，增加促肿瘤生长因子等的分泌来调控免疫相关功能，而诱发肾透明细胞癌细胞的恶性生物学行为。但具体调控过程尚未阐明，还需后续进行深入的探索，以期为肾透明细胞癌治疗的潜在靶点提供实验依据。