山柰酚调控Wnt/β-catenin途径对前列腺癌小鼠T细胞的影响及作用机制

瞿小祥 孔东波 鲁小红 江波涛 邹 伟 查文良 （咸宁市中心医院泌尿外科，咸宁 437100）

前列腺癌是男性最常被诊断出的恶性肿瘤之一，也是癌症相关死亡的第二大诱因［1］。研究显示部分患者会发展为去势抵抗性前列腺癌（castrationresistant prostate cancer，CRPC），CRPC对化疗药物具有较高的抗性和较强的转移能力，这是导致治疗失败和死亡的重要因素，且目前尚无治疗CRPC的有效方法［2］。免疫抑制在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，临床表现为CD4+/CD8+降低，使肿瘤细胞免受机体免疫系统清除。最新研究显示调控T淋巴细胞亚群可延长CRPC患者生存期［3］。山柰酚（Kaempferol）是一种天然类黄酮类化合物，广泛存在于水果、蔬菜和传统草药中，最近有报道称山柰酚具有多种癌症的抗癌作用，如胃癌、乳腺癌和直肠癌等［4-6］，但其在前列腺癌中的作用和机制尚不明确。研究已经证实Wnt/β-catenin通路的激活不但参与前列腺癌的进展和转移，还与CRPC密切相关，而抑制Wnt/β-catenin通路会提高CRPC对化疗药物的敏感性，抑制CRPC的进展［7-8］。近期也有报道显示山柰酚可通抑制Wnt/β-catenin通路抑制口腔癌细胞的增殖并诱导凋亡［9］。ZENG等［10］研究表明，山柰酚可通过调控T淋巴细胞的分化调控免疫。本文主要分析山柰酚调控Wnt/β-catenin途径对CRPC小鼠T细胞的影响，为临床治疗前列腺癌提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人CRPC细胞系PC3（CRL-1435，ATCC公司，美国）；DMEM培养基血清和抗体（Invitrogen公司，美国）；BALB/c裸鼠（上海斯莱克实验动物中心，中国）；山柰酚、TRIzol（Sigma公司，美国）；一抗和二抗（Abcam公司，美国）；PVDF膜（Bio-Rad公司，美国）；ECL显色试剂盒（Thermo Fisher公司，美国）；PrimeScript-RT试剂盒和SYBR Premix Ex Taq试剂盒（TaKaRa公司，日本）；蛋白酶K和TUNEL凋亡试剂盒（Roche公司，中国）；ELISA试剂盒（碧云天公司，中国）；流式细胞仪及小鼠CD4+、CD8+表型抗体试剂（Becton Dickinson公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 分组和建模 通过皮下注射的方式构建CRPC裸鼠模型，将DMEM培养基中处于对数生长期的各组PC3细胞重新配制成浓度为1×107个/ml的细胞溶液，所有小鼠于左侧前肢皮下注射细胞溶液0.2 ml，在建模后第7天有瘤体生成提示建模成功。随机选择30只建模成功的小鼠，随机分为对照组、山柰酚低剂量组和山柰酚高剂量组（n=10）。建模后第8天，山柰酚低剂量组和山柰酚高剂量组小鼠使用山柰酚灌胃，剂量分别为15 mg/kg和30 mg/kg［11］。1次/d。在建模后第28天，小鼠称重，取眼眶血，然后处死小鼠。

1.2.2 肿瘤生长情况观察 每天观察肿瘤生长情况，在第28天统计肿瘤体积，用游标卡尺测量皮下肿瘤体积并使用下式计算：肿瘤体积=［（长度×宽度）/2］3×0.523 6。在建模后28 d脱颈处死小鼠，取出肿瘤组织，检测质量。

1.2.3 Western blot检测增殖和转移相关蛋白 通过Western blot检测增殖和转移相关蛋白CyclinD1、Ki67、MMP2、MMP9，分析细胞增殖和转移能力。将肿瘤组织研磨后收集总蛋白并通过BCA试剂盒检测浓度。应用SDS-PAGE（110 V，100 min）分离30µg总蛋白。分离后，将蛋白质转移至PVDF膜，并在膜上添加1∶500稀释的anti-CyclinD1、anti-Ki67、anti-MMP2和anti-MMP9抗体并孵育过夜。然后在室温下加入1∶5 000稀释的HRP标记的二抗，4℃下孵育2 h。通过ECL检测蛋白印迹带。以GAPDH为内参，通过检测灰度定量分析目标蛋白的表达水平。

1.2.4 TUNEL染色检测凋亡 小鼠经过颈椎脱臼处死，收集肿瘤组织并置于多聚甲醛中固定48 h。将固定好的组织样本利用梯度浓度的乙醇脱水，然后加入二甲苯进行透明处理并以石蜡包埋，使用切片机切成4µm厚的切片。切片水化后制成玻片标本，加入蛋白酶K（20µg/ml）消化，然后按照试剂盒说明书加入TUNEL试剂，于37℃孵育1 h。最后加入苏木精复染。在显微镜下观察细胞，随机选择5个高倍视野，计算每个视野的凋亡指数，取平均值。凋亡指数（%）=凋亡染色阳性细胞数目/总细胞数目×100%。

1.2.5 RT-qPCR检测mRNA TRIzol提取肿瘤组织总RNA，分别利用PrimeScript-RT试剂盒和SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒进行逆转录（60 min/42℃，5 min/70℃，4℃下保存）和qPCR实验（95℃/10 min，40个循环，94℃/15 s，60℃/1 min，60℃/1 min，4℃下保存），以GAPDH为内参。通过比较循环阈值（ΔΔCt）分析RNA表达水平。

1.2.6 Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路

根据1.2.3方法检测肿瘤组织中Wnt3a和β-catenin蛋白表达水平。

1.2.7 流式细胞术检测 通过眼眶取血法收集小鼠外周血，外周血中细胞分别利用CD4+和CD8+标记并分别加入细胞中，在黑暗中孵育2 h后通过流式细胞仪检测小鼠外周血中CD4+和CD8+淋巴细胞亚群的百分比。

1.2.8 ELISA检测外周血中细胞因子水平 将小鼠外周血以2 000 r/min离心20 min后收集上层血清，通过ELISA检测IFN-γ和IL-2浓度，按照试剂盒说明书方法加入抗体和显色剂。使用酶标仪检测450 nm下吸光度，根据标准曲线计算浓度。

1.3 统计学处理 统计分析使用SPSS19.0软件。数据以±s表示，进行ANOVA方差分析，两两比较通过SNK-q检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 山柰酚对前列腺癌裸鼠模型的抑制作用 建模后第28天三组的肿瘤体积和质量比较差异有统计学意义（P＜0.05），山柰酚低剂量组和山柰酚高剂量组的肿瘤体积和质量均显著低于对照组（P＜0.05），且山柰酚高剂量组的肿瘤体积和质量显著低于山柰酚低剂量组（P＜0.05），见表1。

表1 山柰酚对肿瘤体积和质量的影响（±s）Tab.1 Effect of Kaempferol on tumor volume and quality（±s）

表1 山柰酚对肿瘤体积和质量的影响（±s）Tab.1 Effect of Kaempferol on tumor volume and quality（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with Kaempferol low-dosegroup，2）P＜0.05.

Groups Control Kaempferol low-dose Kaempferol high-dose FP n 10 10 10 Volume/mm3 316.46±28.43 241.92±26.971）180.56±21.561）2）36.643 0.000 Quality/g 0.36±0.05 0.28±0.041）0.21±0.03 1）2）25.117 0.000

2.2 山柰酚对前列腺癌裸鼠模型细胞增殖的影响 Western blot结果显示，三组Cyclin D1和Ki67蛋白水平比较差异有统计学意义（P＜0.05），山柰酚低剂量组和山柰酚高剂量组的Cyclin D1和Ki67蛋白水平均显著低于对照组（P＜0.05），且山柰酚高剂量组Cyclin D1和Ki67蛋白水平均显著低于山柰酚低剂量组（P＜0.05），见图1、表2。

表2 山柰酚对前列腺癌裸鼠模型中Cyclin D1和Ki67蛋白的影响（±s）Tab.2 Effect of Kaempferol on Cyclin D1 and Ki67 protein in nude mice model of prostate cancer（±s）

表2 山柰酚对前列腺癌裸鼠模型中Cyclin D1和Ki67蛋白的影响（±s）Tab.2 Effect of Kaempferol on Cyclin D1 and Ki67 protein in nude mice model of prostate cancer（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with lowdose Kaempferol group，2）P＜0.05.

Groups Control Kaempferol low-dose Kaempferol high-dose FP n 10 10 10 Cyclin D1 3.36±0.28 1.97±0.281）1.06±0.091）2）82.694 0.000 Ki67 3.04±0.26 1.82±0.161）0.95±0.081）2）80.275 0.000

图1 Western blot检测山柰酚对前列腺癌裸鼠模型中Cyclin D1和Ki67蛋白的影响Fig.1 Western blot to detect effect of Kaempferol on Cyclin D1 and Ki67 protein in nude mice model of prostate cancer

2.3 山柰酚对前列腺癌裸鼠模型细胞转移能力的影响 Western blot结果显示，三组MMP2和MMP9蛋白水平比较差异有统计学意义（P＜0.05），山柰酚低剂量组和山柰酚高剂量组的MMP2和MMP9蛋白水平均显著低于对照组（P＜0.05），且山柰酚高剂量组的MMP2和MMP9蛋白水平显著低于山柰酚低剂量组（P＜0.05），见图2、表3。

图2 Western blot检测山柰酚对前列腺癌裸鼠模型中MMP2和MMP9蛋白的影响Fig.2 Western blot to detect effect of Kaempferol on MMP2 and MMP9 protein in nude mice model of prostate cancer

表3山柰酚对前列腺癌裸鼠模型中MMP2和MMP9蛋白的影响（±s）Tab.3 Effect of Kaempferol on MMP2 and MMP9 protein in nude mice model of prostate cancer（±s）

表3山柰酚对前列腺癌裸鼠模型中MMP2和MMP9蛋白的影响（±s）Tab.3 Effect of Kaempferol on MMP2 and MMP9 protein in nude mice model of prostate cancer（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with Kaempferol low-dosegroup，2）P＜0.05.

Groups Control Kaempferol low-dose Kaempferol high-dose FP n 10 10 10 MMP2 2.79±0.24 1.43±0.121）0.65±0.061）2）82.694 0.000 MMP9 2.54±0.23 1.21±0.111）0.73±0.071）2）80.275 0.000

2.4 山柰酚对前列腺癌裸鼠模型细胞凋亡的影响 如图3所示，蓝色为被染色的细胞核，棕色为凋亡细胞，如红色箭头所示。结果显示三组的凋亡指数比较差异有统计学意义（P＜0.05）。山柰酚低剂量组和山柰酚高剂量组肿瘤细胞凋亡指数显著高于对照组，且山柰酚高剂量组肿瘤细胞凋亡指数显著高于山柰酚低剂量组，见图3、表4。

表4 山柰酚对前列腺癌裸鼠模型细胞凋亡的影响（±s）Tab.4 Effect of Kaempferol on cell apoptosis in nude mice model of prostate cancer（±s）

表4 山柰酚对前列腺癌裸鼠模型细胞凋亡的影响（±s）Tab.4 Effect of Kaempferol on cell apoptosis in nude mice model of prostate cancer（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with Kaempferol low-dose，2）P＜0.05.

Groups Control Kaempferol low-dose Kaempferol high-dose FP n 10 10 10 Apoptosisindex（%）2.27±0.42 10.05±1.051）17.43±1.891）2）94.822 0.000

图3 TUNEL染色检测山柰酚对前列腺癌裸鼠模型细胞凋亡的影响Fig.3 TUNEL staining to detect effect of Kaempferol on cell apoptosis in nude mice model of prostate cancer

2.5 山柰酚对前列腺癌裸鼠模型肿瘤细胞Wnt/βcatenin基因转录水平的影响 三组肿瘤组织中Wnt/β-catenin基因转录水平比较差异有统计学意义（P＜0.05），山柰酚低剂量组和山柰酚高剂量组Wnt3a和β-catenin mRNA水平均显著低于对照组（P＜0.05），且山柰酚高剂量组的Wnt3a和β-catenin mRNA水平均显著低于山柰酚低剂量组（P＜0.05），见表5。

表5 山柰酚对前列腺癌裸鼠模型肿瘤细胞中Wnt3a和βcatenin mRNA水平的影响（±s）Tab.5 Effect of Kaempferol on levels of Wnt3a andβcatenin mRNA in tumor cells of a nude mice model of prostate cancer（±s）

表5 山柰酚对前列腺癌裸鼠模型肿瘤细胞中Wnt3a和βcatenin mRNA水平的影响（±s）Tab.5 Effect of Kaempferol on levels of Wnt3a andβcatenin mRNA in tumor cells of a nude mice model of prostate cancer（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with Kaempferol low-dose group，2）P＜0.05.

Groups Control Kaempferol low-dose Kaempferol high-dose FP n 10 10 10 Wnt3a 5.84±0.52 3.46±0.351）1.78±0.191）2）162.259 0.00 β-catenin 6.41±0.55 3.75±0.361）1.82±0.201）2）167.522 0.000

2.6 山柰酚对前列腺癌裸鼠模型肿瘤细胞Wnt/βcatenin中蛋白表达水平的影响 三组肿瘤组织中Wnt/β-catenin中蛋白表达比较差异有统计学意义（P＜0.05），山柰酚低剂量组和山柰酚高剂量组Wnt3a和β-catenin蛋白表达均显著低于对照组（P＜0.05），且山柰酚高剂量组的Wnt3a和β-catenin蛋白表达均显著低于山柰酚低剂量组（P＜0.05），见图4、表6。

表6 山柰酚对前列腺癌裸鼠模型肿瘤细胞Wnt/β-catenin中蛋白表达水平的影响（±s）Tab.6 Effect of Kaempferol on protein expression levels of Wnt/β-catenin in tumor cells of nude mice model of prostate cancer（±s）

表6 山柰酚对前列腺癌裸鼠模型肿瘤细胞Wnt/β-catenin中蛋白表达水平的影响（±s）Tab.6 Effect of Kaempferol on protein expression levels of Wnt/β-catenin in tumor cells of nude mice model of prostate cancer（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with Kaempferol low-dosegroup，2）P＜0.05.

Groups Control Kaempferol low-dose Kaempferol high-dose FP n 10 10 10 Wnt3a 3.54±0.33 1.92±0.171）0.91±0.091）2）148.504 0.000 β-catenin 3.42±0.31 2.18±0.201）0.96±0.091）2）146.123 0.000

图4 Western blot检测山柰酚对前列腺癌裸鼠模型肿瘤细胞中Wnt3a和β-catenin蛋白水平的影响Fig.4 Western blot to detect effect of Kaempferol on levels of Wnt3a andβ-catenin protein in tumor cells in nude mice model of prostate cancer

2.7 山柰酚对前列腺癌裸鼠模型T淋巴细胞亚群的影响 三组小鼠的CD4+和CD4+/CD8+水平比较差异有统计学意义（P＜0.05），CD8+水平差异无统计学意义（P＞0.05）。山柰酚低剂量组和山柰酚高剂量组的CD4+和CD4+/CD8+水平均显著高于对照组（P＜0.05），且山柰酚高剂量组的CD4+和CD4+/CD8+水平均显著高于山柰酚低剂量组（P＜0.05），见表7。

表7 山柰酚对前列腺癌裸鼠模型T淋巴细胞亚群的影响（±s，n=10）Tab.7 Effect of Kaempferol on T lymphocyte subsets in nude mice modelsof prostate cancer（±s，n=10）

表7 山柰酚对前列腺癌裸鼠模型T淋巴细胞亚群的影响（±s，n=10）Tab.7 Effect of Kaempferol on T lymphocyte subsets in nude mice modelsof prostate cancer（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with Kaempferol low-dosegroup，2）P＜0.05.

Groups Control Kaempferol low-dose Kaempferol high-dose FP CD4+（%）14.52±1.18 19.45±1.241）23.81±1.361）2）24.068 0.000 CD8+（%）16.97±1.06 16.21±1.30 15.72±1.44 0.542 0.685 CD4+/CD8+0.86±0.07 1.20±0.111）1.51±0.131）2）31.280 0.000

2.8 山柰酚对前列腺癌裸鼠模型血清中IFN-γ和IL-2水平的影响 三组前列腺癌裸鼠模型血清中IFN-γ和IL-2水平比较差异有统计学意义（P＜0.05），山柰酚低剂量组和山柰酚高剂量组的IFN-γ和IL-2蛋白水平均显著高于对照组（P＜0.05），且山柰酚高剂量组的IFN-γ和IL-2水平均显著高于山柰酚低剂量组（P＜0.05），见表8。

表8 山柰酚对前列腺癌裸鼠模型血清中IFN-γ和IL-2水平的影响（±s，ng/ml）Tab.8 Efect of Kaempferol on serum IFN-γand IL-2levelsin nudemicewith prostatecancer（±s，ng/ml）

表8 山柰酚对前列腺癌裸鼠模型血清中IFN-γ和IL-2水平的影响（±s，ng/ml）Tab.8 Efect of Kaempferol on serum IFN-γand IL-2levelsin nudemicewith prostatecancer（±s，ng/ml）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with Kaempferol low-dosegroup，2）P＜0.05.

Groups Control Kaempferol low-dose Kaempferol high-dose FP n 10 10 10 IFN-γ 4.78±0.62 7.23±0.871）9.15±1.121）2）47.198 0.000 IL-2 1.12±0.07 1.40±0.091）1.78±0.111）2）34.275 0.000

3 讨论

前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，尽管前列腺癌通常可以在早期阶段治愈，但转移的患者必须进行雄激素剥夺治疗，而这会使患者发展为CRPC［12-13］。现阶段，治疗转移性CRPC的方法主要为基于多西他赛的化疗，但由于CRPC具有对药物的抗性，且转移能力提高，化疗对患者的生存的益处极为有限，寻找能有效治疗CRPC的药物和方法具有重要的现实意义［14］。

近年来，植物源性药物在全世界引起了越来越多的关注，其具有安全性好、有效性强和副作用小等特点。山柰酚是一种从蔬菜和水果中分离出来的类黄酮化合物，具有广泛的药理活性，例如抗炎、抗氧化、抗糖尿病和心脏保护作用［15-16］。近年来，山柰酚的抗肿瘤活性引起了广泛关注，并且发现其可能具有抑制前列腺癌的作用，一项体外研究显示，在双氢睾酮存在的条件下，山柰酚能以剂量依赖性方式促进前列腺癌细胞及CRPC细胞凋亡，并可抑制体外血管生成能力［17］。也有体外研究发现山柰酚可抑制前列腺癌骨转移，但关于山柰酚对CRPC的体内抑制作用尚不明确［18］。本研究利用CRPC细胞系PC3构建了荷瘤裸鼠模型，并以低剂量和高剂量的山柰酚干预，结果显示山柰酚可剂量依赖性地抑制肿瘤增殖和转移相关蛋白Cyclin D1、Ki67、MMP2和MMP9表达，诱导细胞凋亡，抑制肿瘤生长。此外，本研究结果还显示山柰酚可剂量依赖性地抑制Wnt3a和β-catenin的转录和翻译。大量研究已经证实Wnt/β-catenin通路在CRPC发展中的关键作用，Wnt3a是Wnt配体的关键蛋白，其可通过诱导β-catenin活化，从而直接促进Cyclin D1等促癌基因的转录［19-20］。近年来也有研究表明山柰酚具有调控Wnt/β-catenin信号的作用，如山柰酚可通过调控Wnt/β-catenin信号促进牙周膜干细胞的成骨分化［21］。李红等［9］研究表明山柰酚可通过抑制Wnt/βcatenin通路抑制腔癌KB细胞增殖并诱导其凋亡。黄茂莘等［22］研究发现山柰酚抑制肝癌细胞增殖和转移的能力与Wnt/β-catenin信号通路密不可分。本研究结果和既往文献报道提示山柰酚可抑制CRPC细胞中Wnt3a和β-catenin的转录和翻译水平，从而减少入核的β-catenin蛋白，抑制Cyclin D1、Ki67、MMP2、MMP9等基因的转录水平，从而调控增殖和转移相蛋白表达，抑制CRPC细胞的生长和转移并诱导凋亡。

近年来免疫抑制在肿瘤治疗中备受重视，在正常生理情况下，T细胞亚群保持在一定的平衡范围内，肿瘤的发射管会导致CD4+水平降低和CD8+水平升高，从而使肿瘤细胞逃离免疫系统的监控，并避免被机体清除［23］。CD4+会分泌IFN-γ和IL-2等提高机体免疫能力并诱导巨噬细胞活化，从而抑制肿瘤的进展和转移［24］。本研究进一步分析山柰酚对CRPC裸鼠模型免疫水平的影响，结果显示山柰酚可剂量依赖性地提高前列腺癌裸鼠模型外周血中CD4+细胞比例及CD4+/CD8+，并提高血清中IFN-γ和IL-2的水平。既往也有研究显示山柰酚具有调控免疫和T细胞亚群的作用，有体内研究显示山柰酚具有提高机体免疫能力的作用［25］。LIU等［26］研究结果显示山柰酚可在体外调控T淋巴细胞的分化和增殖，从而缓解牛皮癣。提示在前列腺癌裸鼠模型中，山柰酚可能通过提高CD4+/CD8+水平并诱导IFN-γ和IL-2的水平促进T细胞的生长和分化，激活和招募巨噬细胞和自然杀伤细胞在肿瘤中的增殖聚集，从而有利于肿瘤的清除［27-28］。

综上所述，在前列腺癌裸鼠模型中，山柰酚不仅可以诱导前列腺癌细胞的凋亡，抑制增殖和转移，还可提高CD4+/CD8+水平，促进IFN-γ和IL-2表达，缓解免疫抑制状态。但关于山柰酚在前列腺癌中的作用和调控T淋巴细胞的分子机制仍需要进一步研究。