p H值对粪便微生物移植治疗溃疡性结肠炎小鼠肠道微环境的影响①

潘张磊 王瑞珩 刘跟莉（黑龙江中医药大学附属第二医院，哈尔滨 150001）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是好发于结肠和直肠一种原因不明的慢性、非特异性、炎症性疾病［1］。其发病机制未明，目前认为是由于具有遗传易感性的个体在环境因素触发下，肠道菌群与肠道黏膜免疫构成的肠道微环境失调［2］。肠道菌群异常在其中发挥关键作用，肠道菌群紊乱可使肠黏膜对肠道菌群的耐受降低和肠道上皮屏障受损，从而导致UC相关的异常黏膜免疫反应［3］。肠道黏膜中Treg与Th17作为功能上互相制衡的一对免疫细胞，其比例和功能的稳定与UC病情密切相关［4］。粪便微生物移植（fecal microbiota transplantation，FMT）通过将健康供体粪便中的菌群植入患者的肠道内以恢复肠道微环境稳态。FMT在UC患者中进行的研究表明，FMT能有效缓解UC，但疗效存在差异［5］。肠道内稳定的pH值是维持肠道微环境稳态的重要因素，研究发现在肠道疾病如单纯细菌性腹泻和单纯轮状病毒性肠炎中，患者粪便pH存在异常［6］。故推测FMT疗法中，供体菌液pH值可影响UC的疗效。本实验通过采用不同pH值的菌液进行FMT干预UC模型小鼠，旨在探究pH值对FMT治疗UC和肠道黏膜免疫的影响，为FMT治疗UC的规范化提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级雄性7周龄C57BL/6小鼠100只，购买及饲养于黑龙江中医药大学动物实验中心，许可证号：SYXK（黑）2016-004。葡聚糖硫酸钠DSS购于美国MPBiomedicals公司；尿粪隐血试剂盒购于中国南京建成生物工程研究所；Percoll购于美国GE公司；APCanti-CD4、FITCanti-IL17A、PEanti-CD25、Alexa Fluor 488 anti-Foxp3抗体购于美国BD公司。流式细胞仪为美国BD公司生产，型号为CantoⅡ。

1.2 方法

1.2.1 供体粪便质量控制和菌液制备 招募6名男性健康志愿者提供粪便滤液，要求年龄20～30岁，排便规律，依从性良，符合FMT2016欧洲共识标准。6名志愿者从实验开始前1周严格按照食谱要求进行饮食控制。其中随机2名志愿者为酸性粪便供体，其饮食以糖脂类食物为主；随机2名志愿者为碱性粪便供体，饮食以瘦肉类食物为主；其余2名志愿者为中性粪便供体，其饮食以素食为主。

灌肠前取志愿者6 h内的新鲜粪便称重，按照粪便质量与生理盐水体积比1∶2的比例将两者充分混匀；双层无菌纱布过滤粪便混悬液，收集滤液，离心后弃上清，加入2倍粪便体积的生理盐水，混匀后即为500 mg/ml菌液。所得菌液pH值控制为酸性菌液：pH＜6.9；碱性菌液：pH＞7.2；中性菌液：

6.9≤pH≤7.2。

1.2.2 UC模型复制和治疗 100只雄性C57BL/6小鼠适应喂养1周后，采用随机数字表法分出20只作为Control组，小鼠自由饮用纯净水；其余小鼠自由饮用2%DSS溶液进行造模。7 d后，根据造模小鼠疾病活动指数分为Model组、FMT-L组、FMT-M组和FMT-H组，每组20只。参照人体FMT标准［7］，每只小鼠每次移植的粪菌量为小鼠自身体质量1/500进行灌肠治疗，FMT-L组、FMT-M组和FMT-H组分别给予对应的菌液，Control组与Model组给予等量生理盐水灌肠，2次/d，连续7 d。

1.2.3 观察指标

1.2.3.1 UC疾病活动指数（disease activity index DAI）评价 疾病活动程度的评价参考人体炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）疾病活动度评估方法［8］。于治疗当天开始，根据小鼠每日血便情况和大便性状进行评分：大便性状正常计0分，软但成形计1分，未成形便计2分，稀便计3分。采用邻联甲苯胺法检测小鼠大便隐血情况，大隐血阴性计0分，隐血阳性计1分，便中带血计2分，血便计3分。两项评分相加得分评估疾病活动度。

1.2.3.2 结肠长度测量及病理学检测 第7天，颈椎脱臼法处死小鼠，取回盲部至肛门的结肠，剔除附属组织，于滤纸上舒展开，记录长度。取距肛门1 cm处结肠组织进行HE染色，参照如下标准进行组织病理评分（histopathological score，HPS）：0分，黏膜层正常；1分，黏膜层轻度炎症和水肿，基底部约1/3隐窝消失；2分，黏膜层中毒炎症，基底部约2/3隐窝消失；3分，黏膜层中度炎症，隐窝完全消失但上皮层完整；4分，黏膜层、黏膜下层及肌层中度炎症，隐窝完全消失，上皮层受累。

1.2.3.3 16S测序分析结肠肠道菌群变化 小鼠处死后立即收集结肠内容物，提取内容物细菌的DNA，通过PCR技术，对细菌16SrRNA基因的V3-V4区域进行二轮扩增。同时连接上接头及Index标签序列以获得MiSeq测序文库，后将产物用Illumina Miseq测序平台进行双端测序分析。

1.2.3.4 流式细胞术检测结肠Treg与Th17百分比 参照文献［9］获取肠黏膜固有层淋巴细胞。以CD4+、CD25+、Foxp3+为标记识别Treg，以CD4+、IL-17+为标记识别Th17，染色固定后，于流式细胞仪上检测结肠黏膜固有层淋巴细胞Tregs与Th17百分比［10］。

1.2.3.5 Luminex高通量法分析结肠组织免疫因子 通过Luminex高通量法分析结肠组织中IL-10、IL-17A、TGF-β1、IL-4、IFN-γ、TNF-α等免疫因子的表达水平。

1.3 统计学方法 数据采用SPSS20.0分析，表示为±s或中位数（四分位间距，IQR）。由成组t检验（Mann-Whitney）或单因素方差分析（ANOVA）以及最小显著性差异（Least-significant difference，LSD）检验确定显著性差异。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠的疾病活动程度变化 如图1所示，经DSS诱导第7天，UC模型诱导成功。Model组评分显著高于Control组（P＜0.01）。经治疗后，FMT-L、FMT-M和FMT-H组DAI评分呈不同程度的下降趋势。治疗结束时，FMT-L、FMT-M、FMT-H组与Model组相比DAI评分显著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05）；且FMT-M组降低程度较FMT-L、FMT-H组明显。

图1 各组小鼠疾病活动程度变化Fig.1 Disease activity degree in mice

2.2 小鼠结肠的病理改变 如图2所示，经统计，UC模型处理后显著降低小鼠结肠长度（P＜0.01），经不同pH值FMT移植后，结肠长度较模型组有不同程度的恢复（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05），以FMTM组改善程度最为显著（P＜0.01）。此外，病理HPS评分进一步证明UC造模对小鼠结肠的病理损伤和不同pH值FMT对组织损伤的改善作用。UC造模导致大部分小鼠结肠出现黏膜层、黏膜下层及肌层中度炎症，HPS评分较正常小鼠显著升高（P＜0.01）。经不同pH值FMT干预治疗后，结肠病理损伤得到不同程度改善（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05），且与结肠长度变化趋势类似，以FMT-M干预对结肠病理损伤的改善程度最为显著（P＜0.01）。

图2 各组小鼠结肠长度和结肠组织病理评分情况Fig.2 Length and histopathological score of colon in mice

2.3 小鼠肠道菌群变化 16S测序结肠肠道菌群α多样性特征结果显示（图3），Model组Chao1指数和Shannon指数较Control组相比显著下降（P均＜0.01）；经不同pH值FMT治疗后，Chao1指数和Shannon指数均回升，以FMT-M组上升程度最大（P＜0.01，P＜0.01）。基于OTU水平的NMDS分析结果，图4。组内样本点分布相对集中，组间样本点分布以Control为中心，Model组、FMT-L组、FMT-M组、FMT-H组的样本以逆时针方向分布。即各组组内样本功能分类分布相似，FMT改变结肠肠道菌群分布，且不同pH值下菌群结构存在差异。

图3 各组小鼠结肠肠道菌群α多样性Fig.3 Alpha diversity of intestinal flora in colon

图4 各组小鼠结肠菌落NMDS图Fig.4 NMDSmap of colony in mouse colon

2.4 小鼠结肠Treg和Th17比例 流式结果显示，Model组Treg细胞的比例较Control组显著下调（P＜0.01），经FMT治疗后，Treg细胞比例不同程度回升（P均＜0.01），升高最显著的为FMT-M组（P＜0.01，图5）；Model组Th17细胞的比例较Control组显著上升（P＜0.01），经FMT治疗后，Th17细胞比例不同程度下降（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05），下降最显著为FMT-M组（P＜0.01，图6）。

图5 各组小鼠结肠固有层淋巴细胞中Treg比例Fig.5 Proportion of Treg in lamina propria lymphocytes of colon

图6 各组小鼠结肠固有层淋巴细胞中Th17细胞比例Fig.6 Proportion of Th17 cells in lamina propria lymphocytes of colon

2.5 小鼠结肠免疫因子表达水平 如图7所示，UC造模显著降低结肠中Treg功能相关因子IL-10和TGF-β1的表达（P＜0.05，P＜0.01）；且Th17功能相关蛋白IL-17A和炎症因子IL-4、IFN-γ、TNF-α的表达显著升高（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05），结肠中免疫状态严重失衡，炎症明显。经FMT治疗后，除FMT-H组IL-4的表达和FMT-L组TNF-α的表达外，其余因子的表达水平均不同程度改善（P＜0.05或P＜0.01）。其中，均以FMT-M组的改善作用最为显著（P＜0.05或P＜0.01）。

图7 各组小鼠结肠组织匀浆免疫相关因子表达水平Fig.7 Expression levelsof immune-related factorsin mouse colon tissue

3 讨论

肠道菌群与黏膜免疫的平衡构成肠道微环境稳态，二者相互影响，相互依存。机体能够承载一定范围内的肠道微环境内在变化，而当肠道黏膜存在慢性炎症如炎症肠病、克罗恩病和UC等疾病或潜在的基因改变则可导致肠道微环境稳态、病原菌的清除、定植紊乱以及肠道菌群改变［2］。研究显示UC患者粪便的微生物群落生物多样性减少，通过延缓肠道菌群多样性的丧失，可增强治疗UC的疗效［11］。通过移植肠球菌至遗传易感的小鼠可促进UC发病以及通过移植双歧杆菌至UC模型小鼠后获得良好疗效［12-13］。本实验结果显示UC造模后，其结肠肠道菌群多样性降低，通过FMT治疗改善了以菌群多样性为标志的肠道菌群紊乱。

目前，由于治疗难治性和复发性难辨梭状芽胞杆菌感染的显著疗效，FMT已成为治疗微生物群改变相关疾病的热点。且在轻度至中度UC患者的随机临床试验中，FMT也显示出治疗潜力。尽管如此，目前对FMT发挥治疗UC的机制研究主要集中于宿主代谢调节上，对肠道免疫系统的调节研究仍处于初步阶段［14-15］。研究发现，在急性实验性肠道炎症期间，FMT治疗可调节先天和适应性黏膜免疫反应，从而控制肠道炎症［16］。传统的CD4+T辅助性细胞已被证明在协调肠道炎症反应中起关键作用。相反，调节T细胞群如Tregs和Tr1细胞，参与了对Th17介导UC患者致病反应的控制［10］。Tregs和Th17细胞的动态平衡是维持免疫稳定的重要机制。研究发现，Tregs和Th17细胞调控关系的失衡与炎症、肿瘤及自身免疫疾病密切相关，Tregs和Th17作为功能上相互制衡的一对免疫细胞，已发现在UC中存在比例失调［17］。Tregs通过分泌免疫抑制因子IL-10和TGF-β1等实现免疫抑制功能，Tregs的过度消耗会加重UC。Th17细胞作为促炎细胞，通过分泌IL-17A促进肠道炎症，恶化UC。研究发现通过调节Treg和Th17的平衡，可以改善UC的严重程度［4，18］，而FMT对Tregs和Th17的影响却未见报道。本研究显示，FMT能增加黏膜中Tregs的百分比和Tregs相关抗炎分子IL-10和TGF-β1的水平，同时降低黏膜中Th17的数量和Th17相关致炎分子IL-17A的水平，调节肠道免疫微环境，改善肠道炎症，其中以中性pH值FMT治疗效果最佳。

pH值通常用来检测人体血液的酸碱平衡情况，对各种危重病的诊断及治疗有着非常重要的意义，但粪便pH值的检测临床上应用较少。而实际上粪便pH值是肠道微环境的重要组成部分，在生理情况下保持恒定（pH=6.9～7.2），病理情况下常出现酸碱平衡失调。对急性腹泻患儿粪便pH值的研究发现单纯细菌性腹泻中，83.0%患儿粪便pH值偏碱性，而单纯轮状病毒性肠炎中，67.5%粪pH值偏酸性，二者粪pH值差异显著［6］。不同菌群对环境pH的范围有相对选择性，菌液pH的差异实为菌群分布的差异。大部分细菌的最适pH 6.5～7.5，而大肠杆菌能够在pH=4.5～8.0的环境下生存，且过酸会抑制双歧杆菌的生长和繁殖［19］。故对供体菌液pH值的选择尤为重要。本实验结果证明，不同pH值菌液移植诱导UC小鼠结肠中不同的菌落分布，显著增加UC模型小鼠结肠菌群丰富度和多样性，改善肠道微环境；调节UC小鼠结肠组织中免疫细胞Treg和Th17的比例和功能，改善肠道炎症，缓解UC小鼠病情，且中性pH菌液移植对UC小鼠模型治疗作用及肠道微环境的改善作用最为显著。

综上，本实验首次探讨FMT治疗UC中，菌液酸碱性对疗效的影响，结果提示FMT菌液pH值为中性时，疗效最佳。本实验对提高FMT对UC的治疗具有指导作用和临床意义。