球虫分子生物学检测方法研究进展

程书琪，原慧真，李栋梁，菅复春

(河南农业大学动物医学院，河南郑州 450046)

球虫隶属于顶复门(Apicomplexa)、孢子虫纲(Sporozoea)、真球虫目(Eucoccidiida)、艾美耳科(Eimeriidae)，共4个属，即艾美耳属(Eimeria)、等孢属(Isospora)、泰泽属(Tyzzeria)、温扬属(Wenyonella)[1-2]，大部分球虫具有明显的宿主特异性，不同种的畜禽有着不同种的球虫，互不交叉感染[3]。球虫大部分寄生于肠道上皮细胞，也有某些球虫例如斯氏艾美耳球虫寄生于肝胆管上皮细胞，截形艾美耳球虫寄生于肾小管等。大部分球虫的生活史过程基本相同，整个生活史的完成大约需要1周～4周，包含孢子生殖、裂殖生殖和配子生殖三个阶段，除孢子生殖外，另外两个阶段均在体内完成[4-5]。球虫裂殖生殖阶段可使畜禽发生出血性肠炎等病症，还能引起幼龄动物大量死亡，是严重危害畜禽生长的一类重要寄生虫性原虫，给世界养殖业造成巨大的经济损失[6-7]。目前生产一线常用的检测方法有饱和盐水漂浮法、染色镜检法等，上述方法简单易行，经济实用，但对操作者经验要求高，检出率低，样品前处理过程和制片观察费时费力，且不能区分球虫种属，也不适用于大量样品的检测。基于现代分子生物学的检测方法因其具有高度的特异性和敏感性在实践中逐步得到发展和应用。本文对现有方法做一综述，为进行相关研究及应用提供参考。

1 聚合酶链反应

聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)的原理是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性-低温退火-引物延伸”3步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。Geng T T等[8]基于7种鸡艾美耳球虫的ITS1区基因位点设计了引物，并建立了PCR方法，以确定其调查地区鸡场最易感染的虫种。结果显示7种球虫均能扩增出清晰的目的条带，说明该方法可有效快速鉴别球虫虫种。尽管PCR有诸多优点，但是仍面对着许多挑战，如粪便样品中球虫DNA可获取性有限，模板中GC含量高，扩增的特异性等[9]。因此，仍需探索更加有效的方法。其中球虫的引物如下:

2 多重聚合酶链反应

在传统PCR基础上，You M J[10]使用多重PCR(multiplex PCR)针对E.tenella,、E.acervulina、E.maxima和E.necatrix4种鸡球虫的ITS-1序列进行扩增，设计的引物对，其中通用上游引物为5′-GTTGCGTAAATAGAGCCCTCT-3′，下游引物:E.maxima:5′-ACCAATGCAGAACGCTCCAG-3′；E.acervulina:5′-CAAAAGGTGGCAATGATGCT-3′；E.necatrix:5′-GATCAGTCTCATCATAATTCTC GCG-3′；E.tenella:5′-GTTCCAAGCAGCATGTAACG-3′；这些引物可以将不同种的球虫在20 bp～25 bp的范围内形成扩增产物梯形图，结果可观察到一条均一的条带梯形，该方法可同时检测到4种球虫。梁子平等[11]按照柔嫩艾美耳球虫的ITS-1基因碱基顺序设计了1对特异性引物(ITS1-1:5′-GGGAAGTTGCGTAAATAGA-3′；ITS1-2:5′-CTGCGTCCTTCATCGAT-3′)再针对11种兔球虫分别设计引物(E.flavescens:Efla-1 5′-GAATATTGTTGCAGTTTACCACCAA-3′，Efla-2 5′-CCTCAACAACCGTTCTTCATAATC-3′；E.stiedai:Esti-1 5′-GTGGGTTTTCTGTGCCCTC-3′，Esti-2 5′-AAGGCTGCTGCTTTGCTTC-3′；E.media:Emed-1 5′-GATTTTTTTCCACTGCGTCC-3′，Emed-2 5′-TTCATAACAGAAAAGGTAAAAAAAGC-3′；E.perforans:Eper-1 5′-TTTTATTTCATTCCCATTTGCATCC-3′，Eper-2 5′-CTTTTCATAACAGAAAAGGTCAAGCTTC-3′；E.coecicola:Ecoe-1 5′-AGCTTGGTGGGTTCTTATTATTGTAC-3′，Ecoe-2 5′-CTAGTTGCTTCAACAAATCCATATCA-3′；E.magna:Eman-1 5′-TTTACTTATCACCGAGGGTTGATC-3′，Eman-2 5′-CGAGAAAGGTAAAGCTTACCACC-3′；E.exigua:Eexi-1 5′-GAATAAGTTCTGCCTAAAGAGAGCC-3′，Eexi-2 5′-TATATAGACCATCCCCAACCCAC-3′；E.piriformis: Epi-1 5′-ACGAATACATCCCTCTGCCTTAC-3′，Epi-2 5′-ATTGTCTCCCCCTGCACAAC-3′；E.vejdovskyi:Eve-1 5′-GTGCTGCCACAAAAGTCACC-3′，Eve-2 5′-GCTACAATTCATTCCGCCC-3′；E.irresidua:Eirr-1 5′-TTTGGTGGGAAAAGATGATTCTAC-3′，Eirr-2 5′-TTTGCATTATTTTTAACCCATTCA-3′；E.intestinalis:Eint-1 5′-TGTTTGTACCACCGAGGGAATA-3′，Eint-2 5′-TGTTTGTACCACCGAGGGAATA-3′)。以11种兔源艾美耳球虫的DNA为模板，对PCR条件优化后进行扩增，确定检测有效范围为500 fg～1 pg的DNA，相当于0.8个～1.7个孢子化卵囊。因此，相比较于单病原PCR和显微镜形态学检测，多重PCR方法具有特异、经济、快速的特点。但在筛选引物时，要求其扩增产物的长度有明显差异，以便能在同一电泳胶上显示各自特异性条带，引物的长度、G+C含量、Tm值也应尽可能一致。

3 实时荧光定量聚合酶链反应

实时荧光定量聚合酶链反应技术(real-time fluorescent quantitative PCR，real-time PCR)是在PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术，主要利用加入PCR反应体系中的荧光化学物质来对扩增产物进行连续检测，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析[12]。实时荧光定量PCR技术分为两大类，第一大类是荧光标记探针，如TaqMan探针、TaqMan-MGB探针、分子信标等，Landolfi J A等[13]设计了针对禽类等孢球虫28S rRNA的引物(F:5′-CGTCTGAAACACGGACCA-3′；R:5′-TCAAACCTCTCACAGAGATCGTG G-3′)和探针(5′-TGTACCCCTGTATGCGC-3′)，从雀形目鸟类的粪便样品中检测出等孢球虫，成功建立了雀形目鸟类的TaqMan-MGB探针检测法。

第二大类是双链DNA特异的荧光染料，常用的有SYBR Green。许家园等[14]分别提取黄艾美耳球虫、中型艾美耳球虫和大型艾美耳球虫的DNA，根据GenBank中肠艾美耳球虫的ITS-2序列，设计一段引物，上游引物为F:5′-TTGTTCAATGCTGTTGCCGA-3′，下游引物为R:5′-CCTCATCTTTCCACC ACCGT-3′，用所建立的SYBR GreenⅠ实时定量荧光PCR进行检测，具有很好的灵敏性，最低可以检测1个卵囊，虽然特异性不如TaqMan探针法，但使用特异性强的引物，优化反应体系和条件，也能达到很高的特异性[15]。

4 套式聚合酶链反应

套式PCR(nested PCR)是一种变异的聚合酶链反应，使用两对PCR引物扩增完整的片段。套式PCR的好处在于，如果第1次扩增产生了错误片段，则第2次很难扩增出目的条带。因此，套式PCR特异性很强。温福利[16]基于兔E.stiedai的ITS-1基因，设计了第1轮引物为F1:5′-TTGGGTGGGTTTTCTGTGCC-3′，R1:5′-CGCGAGCCAAGACATCCATT-3′，第2轮引物为F2:5′-GGTTCGGTCACCTCTGCATT-3′，R2:5′-CAGCACCATCATCCACAGGA-3′，两轮扩增的退火温度分别为53 ℃和60 ℃，成功建立检测限为1个斯氏艾美耳球虫卵囊套式PCR的方法。

5 高分辨熔解曲线分析技术

高分辨熔解曲线分析技术(high-resolution melting analysis，HRM)是一种突变扫描和基因分型的遗传分析技术。HRM方法基于传统PCR技术，不受突变碱基位点与类型限制，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性(SNP)、甲基化、HLA配型等的分析。叶英娣等[17]为了准确鉴别兔球虫虫种，基于ITS-1序列设计了1对通用引物，上游引物(ITS-1 F):5′-GGGAAGTTGCGTAAATAGA-3′，下游引物(ITS-1 R):5′-CTGCGTCCTTCATCGAT-3′，建立了PCR-HRM方法，通过 Rotor-GeneQ系列软件分析，可知6种兔艾美耳球虫中，黄艾美耳球虫与维氏艾美耳球虫有2个Tm值，熔解曲线表现为双峰，其余4种兔球虫则为单峰，且无非特异性扩增和引物二聚体。该方法具有快速、特异、敏感和稳定的特点，可用于兔球虫的检测。但是在使用HRM方法时，片段的大小和染料的性质会对其产生影响[18-19]。

6 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是由日本学者Notomi等创建，首次报道于2000年，它利用识别多区域特异性引物组和具有链置换活性的BstDNA聚合酶，在65 ℃左右条件下，1 h能扩增出高达109拷贝的靶序列[19]。温福利等[20]针对兔斯氏艾美耳球虫的ITS-1-5.8S rRNA-ITS-2基因序列设计了6条引物(FIP:CCAGACGACACCATCACCGTCTTGCTATATGCGAGAA，BIP:GCGTCGAATGGTTGGTTGTTGTTCCATTTGGAAGGAGAT,LP:CATCGAAGAACCAATCTATAG,LF:CGTCGTCTAGAATTTATGG，F:CGCTGTAATCATGTTTGAT,B:TATACATACAGGTATGTGCT),创建了LAMP方法，先以样品卵囊DNA为模板，进行PCR扩增，上游引物为5′-TGGCTTTCGCCAACCAACAT-3′，下游引物为5′-CTGCCTGCGCCAGTAGTA AC-3′，扩增片段为261 bp，对反应体系、酶添加量、DNA添加量等条件摸索优化后建立的LAMP与常规PCR相比，灵敏度高10倍～100倍。Barkway C P[21]针对7种鸡艾美耳球虫设计了引物(E.acervulina:F3 5′-CCTAACATTTCGCTTCACGGAC-3′，B3 5′-ATGAGCAAGTGGAACACCTTG-3′，FIP 5′-AGAGCACAGTGGCAGTGCAGCAGACAGCATGGCTTACCT-3′，BIP 5′-GAAGACCCTCTGAAGAACGGACCTTCTCACC

GCTTACCGG-3′，LB 5′-TAAGGTTACACCCGTG GAGG-3′，LF 5′-GCCATGCACAAAGCGACTT-3′；E.brunetti:F3 5′-GGCCATCAAGTTCCATGAGC-3′，B3 5′-TCAACCTCCTGAGTGTGGTT-3′，FIP5′-GAAAA

实验结果表明：当经受浓度为5%以下的海水胁迫时，厚萼凌霄种子的发芽率、发芽势、发芽指数、平均根长均有所下降，但下降趋势平缓，与对照组差异不明显；当海水浓度在20%以下时，厚萼凌霄的根长与对照组差异不明显，这说明厚萼凌霄根部对海水胁迫具有耐受性；当海水浓度达到30%后，厚萼凌霄种子萌发的各项指标与对照组有明显差异，这说明厚萼凌霄种子对低浓度的海水具有一定的耐受性。

TGCCTTCGTAGCTGCTGCTGGGTACGGAGCGTC

TT-3′，BIP 5′-TACTTCCTAGGATCCATCCTCGCAG

TTTCGCTGCCGCCTC-3′，LB 5′-GAAACGCTCGAACATGGC-3′，LF 5′-CTTCTCCACAGACCCAGAGGT-3′；E.maxima:F35′-ACTACGGAAAAGTGCGTAGCT-3′，B3 5′-CCTTCCTCCCTTCTGAAAACTG-3′，FIP5′-GAGTCACTGCTGATGTACCAAAAGGAA

CTATGCCGCTTTCCCCTG-3′,BIP 5′-AGAATGCGGATTTGTTAGCAGCAGCAAGTCCAAGGTGTGTG

TA-3′，LB 5′-CAAGCCTACGCGGACATC-3′，LF 5′-TTATGCAGCTGGGTCAACG-3′；E.mitis:F3 5′-ACGATAGCCAAGACACGTAAGG-3′，B3 5′-CCCCGTGATAAGAGTAGGAACA-3′，FIP 5′-CGCGGGTCGTGAGATTTAAATTATGGAAGATCAGGACGGGCAC

T-3′;BIP5′-GTTTCAGTTGATGAACAAGCGAG

ATGCGCCTCTAGAATCAAGACG-3′;LB 5′-TCCATGCATCCCCTTGTT-3′，LF 5′-CGTGGGCACAGATTGATTC-3′；E.necatrix:F3 5′-TGGCTTTCCCGCGTACC-3′，B3 5′-CGGCCCAACACAAAGACTG-3′;FIP 5′-CGCTTGAGTTTTAAGCTATGCACAGACCCAAGCAGCTCACC

AA-3′，BIP 5′-CGCCATGCCATTCAATGAACGGAGGCATACCGGCGTTGTC-3′，LB 5′-GTCTGTAACTTGGGACGTTGT-3′，LF 5′-GAACAGCCGGAGCCTCTC-3′，E.praecox:F3 5′-GCCCTT

GTATGTTGCTGTTTCT-3′，B3 5′-GCGCACGA

ATCTGAATCACAC-3′，FIP 5′-ATCTCCTCAAA

GACTTTCGCGTAGCGCTTGGCTATATCCATAGG-3′,BIP 5′-GCTCTCGTGGCATACTTGC

GCCAGGAGCCACTGATTGT-3′，LB 5′-GAATAGCATTGCCAGGTGG-3′，LF 5′-GTCCACTGTCATTAATATTGCTGC-3′；E.tenella:F3 5′-GCTTGTGAAGGTCAGCGTG-3′，B3 5′-GCTGA

GTCCATACGTACTTCCT-3′，FIP 5′-GCCACTGCTATGGAAAGTCACACCATAACTGGCATG

CAGGGGT-3′，BIP 5′-GTTTGGCCCGAAAGTTGTGGTCAGAAATTGCTGCCCAAT-3′，LB 5′-C

GCATGTGCAGTTGAAGACA-3′，LF 5′-CCAAA

TGTATCTGCTAGTTATATTAACAAG-3′),建立了的LAMP方法。该方法为家禽饲养提供了一种有价值的球虫检测工具，其突出优点在于检测所需时间短，无需昂贵的仪器，检测结果可视化，加上其检测方法的多样性，使LAMP技术得到快速发展，在寄生虫检测方面将作出更大贡献[22]。但是引物之间的杂交概率提高，容易产生假阳性，且产物易形成气溶胶污染，所以对操作人员和操作过程要求较高[23-24]。

7 纳米PCR检测方法

纳米PCR(nanoparticle-assisted-PCR，nano-PCR)是将纳米粒子(1 nm～100 nm)引入PCR体系而建立的一种新型PCR方法。王一等[25]针对毒害艾美耳球虫ITS-2基因序列设计了1对引物，上游引物EnITS-2F:5′-TCGCTCTCTGTTCCTCATGTTCC-3′，下游引物EnITS-2R:5′-GCWCCTCCTCCTCTAGCCTT-3′，在PCR反应体系中加入纳米粒子，建立了能够高效、特异地检测方法。该方法成功扩增出毒害艾美耳球虫约380 bp的特异性片段，其最低检出质量浓度为3.64 μg/L，敏感性是普通PCR的100倍。纳米粒子能够显著提高PCR扩增效率和减少非特异性扩增，增加特异性扩增的产量[26]。但是该方法是否可以用于其他球虫仍有待验证。

8 电子微阵列技术

电子微阵列技术(electronic microarray)是人类基因组计划的逐步实施和分子生物学迅猛发展及运用的产物，该技术的原理是在芯片表面上集成已知序列的基因探针，被测细胞或组织中大量标记的核酸序列与探针进行杂交，通过检测相应位置的杂交探针，实现快速检测。Niroshan T D等[27]为检测引起牛腹泻的多种病原，设计了DNA微阵列方法，涵盖了4种细菌(产气荚膜梭菌、大肠埃希氏菌、都柏林沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌)、3种原虫(邱氏艾美耳球虫、牛艾美耳球虫、小球隐孢子虫)和4种病毒(牛环曲病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒)的电子微阵列检测方法，结果表明该方法有着非常高的灵敏度和特异性，可快速识别不同目标病原，为快速检测、监测、诊断牛肠道病原提供了高效的手段。

9 限制性片段长度多态性聚合酶链反应

限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)是通过PCR扩增目的片段，然后用限制性内切酶进行酶切，电泳后观察比较限制性图谱来分析序列之间的差异。由于不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，可以产生不同长度的DNA片段条带。Pyziel A M[28]基于牛源艾美耳球虫的18S rRNA设计了2条引物，(上游引物为5′-TTTCGACGGTAGGGTATTGGCCT-3′，下游引物5′-ACGAATGCCCCC AACTGTCC-3′)，进行PCR扩增后用AluⅠ和Hind Ⅲ (NlaⅢ)、MvaⅠ (BstNⅠ)和KpnⅠ限制性内切酶进行酶切或双酶切，根据酶切条带模式确定不同球虫种类。该方法可有效鉴别种类，简单、快速，可用于常规实验室检测。

10 球虫核酸检测方法展望

球虫分子生物学检测和鉴定很多，无论哪种方法，DNA扩增引物的设计是关键，引物的特异性直接影响鉴定结果的准确性。目前引物设计报道最多的一类是基于核糖体基因，在18S rDNA与5.8S rDNA之间以及5.8S rDNA与28S rDNA之间有内转录间隔区(ITS)，进化速度快且序列较短，适用于种间的遗传关系分析、虫种的鉴定和分类，因此通常会在18S、28S rDNA上设计引物得到中间的ITS区域，从而为我们提供一种灵敏度高、特异性强的较为准确且标准化的检测手段；另一类是基于线粒体基因组的鉴定技术，mtDNA以母系方式遗传，核苷酸进化速度快，具有广泛多态性等特点使得其经常被作为遗传标记。但该类鉴定方法检测过程繁琐，需特殊仪器设备及人员素质要求高，大大降低了在基层的推广使用。

球虫种类多，多为混合感染，不同的球虫潜伏期和感染的部位不同，危害也不同[29-30]。在动物感染早期准确检测出球虫及其种类，为找寻解决方案争取时间，从而有效控制球虫病，因此对球虫检测方法的研究应进一步加强与深入，比如LAMP、纳米PCR等在其他寄生虫中使用良好灵敏度高，而对于球虫的报道比较少，可以加强研究与应用。相信随着球虫基础研究的深入和交叉学科的发展，可能会有技术上的创新与突破，从而出现更高效更便利的检测方法。