犬瘟热病毒检测方法研究进展

王改丽,呼延含蓉，程荣华，郭衍冰，郝良玉，刘沂霖，李昱洁，姚新华*

(1.吉林省畜牧兽医科学研究院，吉林长春 130062；2.吉林省动物疫病预防控制中心，吉林长春 130062；3.吉林省畜牧业管理局，吉林长春 130000)

犬瘟热(Canine distemper，CD)是由麻疹病毒属成员犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)引起犬的一种急性发热性、接触性传染病，可感染多种家养动物和野生动物，对世界各地的濒危物种保护构成威胁。CDV感染会导致淋巴细胞减少和长时间免疫抑制，且易造成继发感染。患犬临床症状表现为发热、卡他性呼吸道症状、胃肠道疾病、皮疹和中枢神经系统疾病。自1950年以来，CDV疫苗的广泛使用有效控制了多个国家和地区CD的暴发。但近年来免疫动物包括家养和野生动物发病的报道不断增多，非人灵长类猴群致病率和病死率分别可达60%和30%。研究发现商业疫苗株和流行的CDV野毒株抗原之间存在较大差异，导致现用疫苗不能达到完全的免疫保护。此外，CDV宿主范围的不断扩大，来自不同地域或在不同物种宿主间传播导致其生物学特性发生变化，其基因也更加多样性。因此，对CDV的检测方法进行综述，以期为CDV的诊断提供有效的检测方法。

1 基因组结构

CDV颗粒为多形性，多为球形，直径约150 nm。CDV为有囊膜包裹的、单股、不分节段的负链RNA病毒。目前，CDV仅有1个血清型。CDV基因组约15 690个核苷酸，编码6个结构蛋白，核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)和大蛋白(L)，而P基因分别利用重叠的开放阅读框(ORF)和在mRNA合成过程中插入非模板G残基进行RNA编辑编码C和V非结构蛋白，V和C蛋白能够阻碍宿主的先天性免疫应答反应[1]。其中，N蛋白在CDV转录复制过程中具有调节和装配的作用；P和L蛋白为转录酶相关蛋白；M蛋白与病毒粒子的装配和感染释放相关；H和F蛋白为病毒囊膜糖蛋白，在病毒吸附和侵入宿主细胞过程发挥重要作用[2]。H蛋白是CDV嗜性蛋白，能够调控宿主特异性，也是变异性最大的蛋白，在CDV毒株之间核苷酸差异可高达11%，是研究CDV变异和进化的适宜靶点，常将H蛋白作为CDV分型依据[2]。F蛋白在诱导病毒囊膜与宿主细胞膜融合反应过程中发挥重要作用，介导二者膜融合，完成CDV入侵宿主细胞过程[3]。

2 流行病学特点

CD是由CDV引起的高度接触性传染病，感染犬科动物后其病死率为30%～80%，雪貂的病死率甚至可达100%。该病一年四季均可发生，但冬季、春季多发，不同年龄、性别及品种的犬均可感染，但是1岁以下的犬最为易感。目前，CDV只有1个血清型，通过对疾病流行地区H基因的比对分析发现目前CDV毒株同时有多个基因型流行[4]。CDV的主要传染源为发病动物、隐性感染的带毒动物及其排泄物，其中眼、鼻分泌物、呼吸道及粪便中病毒载量较高。CDV可经垂直和水平方式传播，被污染的水、食物、环境等是CDV的主要传染途径。

CD最初被认为是一种家犬易感的传染性疾病，但目前CDV已经成为世界范围内的多宿主病原体，自然感染宿主范围广泛，包括犬科、猫科、鼬科、浣熊科、鬣狗科、熊猫科以及灵长目猕猴科、偶蹄目猪科、鳍足目海豹科、鲸目海豚科等；还有CDV感染大熊猫和东北虎致死的报道[5]。CDV可跨宿主种属传播，其感染谱系呈不断扩大趋势。此外，CDV还可人工感染豚鼠、地鼠、小白鼠及松鼠猴等动物。虽然目前尚无人类感染CDV的报道，但在人类癌细胞系如乳腺癌、肺癌和前列腺癌细胞系均可分离获得CDV，研究人员在人Paget变形性骨炎患者骨组织中检测到CDV核酸及抗原，推测CDV可能与慢性骨病发生相关，但是CD是否为潜在的人兽共患病还需进一步研究证实。

3 临床表现

CDV能够引起动物消化、呼吸和神经系统等多系统病症[6]，不同病毒来源、数量、毒力强弱和患病动物免疫力不同其临床症状也不同，临床表现主要为双相热、胃肠道炎症、上呼吸道炎症、卡他性肺炎及神经症状。患病犬主要临床症状为双相热，初期精神沉郁，食欲减退，鼻镜干燥、龟裂，结膜潮红肿胀。消化系统症状病犬常发生腹泻，排血便或伴有黏液的粪便，有时可见呕吐。呼吸系统症状病犬眼、鼻可见有水样分泌物，严重时可见有脓性分泌物，咳嗽，打喷嚏，肺炎，呼吸困难。神经症状病犬可见局部如口唇、耳根及眼睑抽搐，重症空嚼，流涎，步态不稳、转圈、共济失调、肌肉痉挛等，一般出现神经症状的病犬预后不良[7]。部分病犬也会出现釉质发育不全、红色丘疹、足垫角质化等症状。根据病犬发病史、临床症状并结合流行病学情况进行初步诊断，确诊还需结合实验室诊断。

4 犬瘟热病毒检测技术

4.1 病原检测

4.1.1 病毒分离鉴定 病毒分离是诊断犬瘟热最确切的方法，但CDV对环境的抵抗力很弱，易在外界环境中灭活，病毒的分离率很低，且病毒分离培养及鉴定工作量较大。临床上常用犬或貂肺泡或腹腔巨噬细胞或被感染组织与健康犬有丝分裂原刺激的淋巴细胞共培养分离CDV。但是分离培养原代细胞费时费力，且传代次数少。因此，建立方便、快捷分离培养的细胞系对CDV致病性研究显得尤为重要。犬瘟热病毒受体信号淋巴细胞激活分子(signal lymphatic activation molecule，SLAM)的发现，为构建稳定表达SLAM细胞系奠定了基础。Seki F等[8]分别用表达犬细胞SLAM的Vero细胞系与B95a细胞和Vero细胞分离CDV感染病料，Vero细胞未成功分离到CDV病毒株，B95a细胞通过连续传代,在7 d～10 d后分离到3株，而SLAM-Vero细胞系在24 h分离获得5株CDV病毒株，表明稳定表达SLAM受体细胞系能极大提高CDV的分离率。刘玉秀[4]构建了Vero/DogSLAM细胞系，利用该细胞系分离获得猴源和犬源CDV野毒株，在接种病料36 h～48 h可见典型细胞病变，极大地缩短了病毒分离时间，为CDV分子特性研究提供了基础。但该方法对试验条件要求较为苛刻，不适于CDV的快速检测，难以在基层临床中推广应用。

4.1.2 电镜观察 通过电镜负染、超薄切片法和液相免疫电镜等观察病毒粒子是检查、确定CDV感染最简便快速的方法。将采集的临床样品经磷钨酸负染后可直接进行电镜观察，只需2 h～3 h就可完成整个操作过程。在病毒不易提纯或无高效价高滴度抗体的情况下，可通过离子捕获法纯化CDV，进行电镜观察，整个过程仅需1 h～2 h，方便快速。研究人员将离子捕获电镜技术与免疫电镜技术结合起来，建立了改良离子捕获电镜法，提高了完整粒子的检测率，且效果优于单纯离子捕获电镜法。但是电镜检查对病毒数量和操作人员要求较高，且该法在病毒鉴定时只能观察病毒的外观形态，很难与同科的病毒相区别，因此一般不作为常规手段。

4.1.3 包涵体检测 采集病犬眼结膜、鼻黏膜、膀胱刮取物和外周血液等制成涂片，或取病死犬淋巴、肺、脑组织等做常规石蜡切片，进行HE染色，镜检可在核内和胞浆观察到红色或暗红色的圆形或椭圆形嗜酸性包涵体，是CDV感染的重要标志之一。但狂犬病病毒和犬传染性肝炎病毒等也可形成包涵体，因此仅通过包涵体检测难以确诊，可通过与其他检测方法结合如免疫荧光技术对包涵体内病毒抗原进行诊断。

4.2 免疫学检测技术

4.2.1 琼脂扩散试验 任文陟等[9]用CDV病貉肝脏制备琼脂扩散抗原，CDV鸡胚成纤维细胞弱毒疫苗免疫绵羊制备琼脂扩散抗体，建立了CDV琼脂扩散试验(agar gel precipitation,AGP)，用于检测病死动物脾脏、肝脏中CDV抗原，与电镜检查结果总体符合率为90%(9/10) 。该方法操作简便，易于在兽医临床推广应用，但其灵敏性较差。

4.2.2 酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)具有特异性高、灵敏度强、适用范围宽、检测速度快等优点，可用于病毒抗原或动物血清中抗体检测，已广泛用于动物疫病的诊断。郭霄峰等[10]建立了检测犬瘟热病毒及抗体的间接ELISA方法，具有良好的特异性、敏感性和准确性，可作为定量检测犬瘟热病毒抗体含量的有效方法。张鸿等[11]用CDV单克隆抗体作为捕获抗体，以辣根过氧化物酶标记的第2种CDV单克隆抗体为检测抗体，建立了单克隆抗体夹心ELISA方法，特异性良好，该方法敏感性接近于套式PCR，两种方法的符合率为85%。研究人员将杆状病毒重组表达的CDV N蛋白作为包被抗原建立了捕获夹心ELISA方法，用于检测犬血清中抗CDV特异性的IgG和IgM含量，可用于急性犬瘟热诊断。通过简化血清免疫球蛋白的检测程序，研究人员还建立了IgM-ELISA方法，可用于犬和水貂CDV早期感染的检测。国内学者将建立的三抗体夹心Dot-ELISA法用于CDV抗原检测，其最低抗原检出量为1.15 μg/mL，比常规ELISA具有更高的敏感性和特异性。

4.2.3 血清中和试验 血清中和试验具有较强的特异性和敏感性，是检测动物体内CDV抗体水平和疫苗免疫效果的标准方法。乔贵林等[12]用CDV弱毒及自制的高免犬血清建立了检测CDV抗体的中和试验。研究人员在此基础上进行了优化，采用微量血清法进行中和试验，其特异性、敏感性更高。但是微量血清中和试验的试验周期长，结果容易误判，不适于临床快速诊断，仅适用于实验室的诊断。

4.2.4 免疫荧光技术 免疫荧光技术(immuno fluorescence assay,IFA)又称荧光抗体技术，是目前国际公认的检测CDV的通用方法。荧光抗体技术方便、快捷、特异性高，是目前实验室常用的检测方法，尤其适用于不产生细胞病变的CDV强毒株检测。研究人员将CDV抗体进行荧光标记，通过直接免疫荧光技术对CDV感染病犬样品进行检测；以及特异性抗体与相应抗原反应形成抗原-抗体复合物后，利用荧光素标记的第二抗体与复合物中第一抗体结合，通过显微镜下观察特异性荧光，检测临床样品CDV抗原或抗体，该间接免疫荧光方法比直接免疫荧光法敏感度高。汤永平等发明了检测CDV的免疫荧光层析检测卡，其灵敏度高，检测结果可靠[13]。陈翠翠等以抗CDV单克隆抗体为包被抗体，Eu3+标记的另一种CDV单克隆抗体作为检测抗体，建立了检测CDV的双抗体夹心时间分辨免疫荧光分析方法，该方法具有良好的特异性、灵敏度、准确度(稀释回收率)及稳定性，该方法与RT-PCR法检测临床样本的符合率为100%[14]。免疫荧光技术存在易产生非特异性荧光的缺点，且需要特殊的仪器设备，适用于实验室诊断。

4.2.5 免疫组织化学技术 免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IHC)主要用于被感染动物的死后诊断，可对病原在组织器官和细胞中的分布情况和定位进行检测。研究人员通过IHC对犬瘟热病貉体内CDV的分布及定位进行检测，发现扁桃体是CDV分布最为广泛的器官。刘雯等[15]建立了间接IHC方法，对人工感染的比格犬肠组织的CDV进行组织定位检测，发现CDV主要分布于李氏隐窝的上皮细胞胞浆内和小肠绒毛中，该方法具有较强的特异性和灵敏性。但 IHC过程复杂，需要专业人员进行操作，且检测结果易发生非特异性染色问题，不适于基层临床推广应用。

4.2.6 胶体金免疫层析技术 胶体金免疫层析技术(colloidal gold immunochromatography assay,GICA)将胶体金为示踪物，以硝酸纤维素膜作为抗原或抗体的固相载体，在特定区域发生抗原抗体特异性反应信号的一种快速检测技术，该检测方法特异性强、结果易判定、快速简便、不需要额外的仪器，已被广泛应用于兽医临床和宠物医院中，是诊断治疗的重要辅助手段[16]。苏建青[17]建立了CDV胶体金免疫层析试纸，与CDV直接免疫荧光方法的特异性和灵敏性相当，且该试纸不需要仪器设备，适用于基层兽医临床的应用。孙婧[18]用单克隆抗体建立了CDV胶体金免疫层析检测方法，该方法具有良好的特异性，操作简便，能够实现CDV快速诊断和临床样品的快速筛查。邓柏林等[19]发明了一种用于检测样品中CDV和犬细小病毒的双重检测试纸卡，该试纸卡具有操作简便快速、可通过肉眼判读结果、无需特殊试剂和仪器等优点。

但CDV胶体金试纸敏感性差，无法定量，只能对样品进行定性检测和半定量检测，重复性差。研究人员将聚合酶链反应及环介导等温扩增技术与胶体金免疫层析法相结合，用于检测病原体核酸。研究人员将聚合酶链反应与胶体金免疫层析法相结合，建立了检测乙型肝炎病毒核酸的方法，该方法与实时荧光聚合酶链反应方法阳性检出率无差异；并在传统免疫层析试纸条上增加了内控检测带，实现了病原体的可视化检测，该方法特异性好，灵敏度高，操作便捷，且能有效避免假阴性结果。国外学者将胶体金免疫层析技术和环介导等温扩增技术结合，建立了Ⅲ型锦鲤疱疹病毒快速检测方法，该方法特异性和敏感性较高、且大大缩短了检测时间。因此，将CDV胶体金免疫层析检测方法与聚合酶链反应等方法相结合，能够实现临床样品的快速诊断，也可使检测结果更为准确、可靠。

4.3 分子生物学检测方法

4.3.1 聚合酶链反应 聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是针对目标基因序列设计特异性引物，扩增目的基因的一种检测方法，该方法特异性和敏感性强，已成为核酸诊断的“金标准”，目前已被广泛应用于病原体等方面的检测。李金中等在国内首次针对CDV融合蛋白基因序列建立了CDV的RT-PCR诊断方法，该方法具有敏感性和准确度高及特异性强的特点，可用于CDV临床诊断和实验研究。临床样品检测过程中，常发现CDV与犬细小病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒Ⅱ型等混合感染，单一PCR检测方法耗时长，不能满足对多种抗原类型的快速鉴定。因此，许多学者陆续建立了可检测多种病原体的多重PCR方法。俞向前等[20]建立了一种快速检测CDV、犬细小病毒和犬呼吸道冠状病毒的多重PCR方法，通过对临床样品检测发现，该多重PCR方法与单一PCR方法检测结果一致，且省时、省力，还极大地节约了成本，可用于常见犬呼吸道常见传染病的流行病学调查，并可在临床病症相似情况下实现快速鉴别诊断。罗亚坤等[21]针对CDV N基因序列、犬冠状病毒M基因序列和犬细小病毒VP2基因序列分别设计特异性引物，建立了多重纳米PCR(nano-mPCR)检测方法，该方法特异性和敏感性良好，其敏感性比普通PCR高100倍，为CDV、犬冠状病毒和犬细小病毒的临床鉴别诊断提供了新方法。

套式PCR(nested PCR,nPCR)方法又称巢式PCR，具有更强的特异性和敏感性，目前已广泛用于兽医临床诊断。Shin Y J等[22]针对CDV N基因建立了套式PCR方法，将RT-PCR和套式PCR方法用于疑似CDV感染病犬的血液、尿液、鼻拭子和唾液检测，结果发现套式PCR敏感性高于常规PCR方法，且阳性检出率更。Si W等人建立了一种多重逆转录套式PCR(RT-nPCR)方法，能够检测和鉴别CDV野毒株和疫苗株感染，可用于临床快速检测及流行病学调查[23]。Martella V等[24]根据CDV不同谱系H基因的特点，建立了半套式PCR，可对样品进行鉴定及分型。

实时荧光定量PCR(real-time PCR)技术是在常规PCR技术基础上发展起来的特异性和敏感性更强的核酸定量技术，该技术最早由美国Applied Biosystems公司推出。在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光标记的特异性探针，通过实时监测荧光信号变化，分析目标序列拷贝数，结合已知量标准品对靶序列定量。付运星等[25]针对CDV核衣壳蛋白基因序列，建立了一步法荧光定量PCR技术，可实现实时定量分析，灵敏度是普通RT-PCR方法的100倍，且重复性良好。王艳杰等[26]选取高度保守且具有型特异性的CDV、犬腺病毒Ⅱ型、犬细小病毒和犬副流感病毒基因序列，设计特异性引物及TaqManMGB探针，建立了检测CDV、犬腺病毒Ⅱ型、犬细小病毒和犬副流感病毒的4重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法，适用于临床CDV、犬腺病毒Ⅱ型、犬细小病毒和犬副流感病毒的快速鉴别诊断。研究人员还建立了鉴别犬瘟热强弱毒株的SYBR Green Ⅰ 荧光定量RT-PCR检测方法，能有效区分CDV野毒株与弱毒疫苗株。荧光定量PCR技术具有高特异性和敏感性，对处于亚临床或潜伏感染的患病动物进行诊断时均能获得很好的结果。然而，荧光定量PCR方法需要特殊的仪器设备，难以在临床进行大范围应用，只可满足实验室的检测及分析。

4.3.2 环介导等温扩增技术 环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP) 是Notomi T 等开发的一种新型、便捷的等温核酸扩增技术。LAMP通过不同引物可同时识别多个不同目标序列，在链置换DNA聚合酶作用下进行指数扩增，因此具有很高的灵敏度和特异性。与传统PCR方法相比，LAMP不需要热循环阶段，在DNA聚合酶作用下即可实现快速扩增，且试验结果可通过肉眼直接观察或使用LAMP实时浊度仪测定焦磷酸镁的混浊度以及通过添加荧光染料实现实时监测。LAMP方法反应速度快，不需要昂贵仪器，只需恒温水浴锅，从而有助于降低检测成本。Liu D F等[27]针对CDV H基因建立了用于鉴别检测CDV野毒株与疫苗株感染的反转录-环介导等温扩增方法(RT-LAMP)，于65 ℃水浴锅中反应40 min即可完成CDV野毒株检测，特异性高，与犬细小病毒、狂犬病病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒无交叉反应，其敏感性是常规RT-PCR方法的100倍。王林等[28]发明了用于快速检测犬瘟热病毒的荧光可视化RT-LAMP试剂盒，该试剂盒具有较高的特异性，检测灵敏度为10拷贝，操作简便，检测结果不需进行电泳，可通过肉眼直接观察，适用于兽医临床快速检测。郝镯等[29]将LAMP与横向流动试纸条(lateral flow dipstick，LFD)相结合，建立了RT-LAMP LFD检测方法，其检测CDV下限为1×102个拷贝/mL，该方法特异性强，敏感性高，操作方便，检测结果易于观察，可用于临床诊断。

目前，LAMP检测技术具有敏感性高，操作便捷、成本低、适用于临床现场检测等优势，已被广泛用于食品微生物检测、临床医学检测、动物病原微生物检测等。但是LAMP也存在气溶胶污染，检测结果易出现假阳性，且扩增产物无法进行克隆测序等缺点。因此，通过不断优化改进LAMP检测方法，消除携带污染，降低假阳性，LAMP检测技术将成为临床诊断中最具潜力的检测方法。

4.3.3 重组酶聚合酶等温扩增技术 重组酶聚合酶等温扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)是一种新型的等温核酸扩增技术，利用重组酶与上、下游引物结合形成蛋白-DNA混合物并启动寻找模板DNA上的同源序列，引发链置换反应。RPA不需要变温过程，扩增效率高，特异性好，灵敏度高，操作简单，适合临床快速检测，应用前景广阔，且RPA检测结果读取方式多样。Wang J等[30]将普通RPA方法结合琼脂糖凝集电泳对猪圆环病毒进行分析检测，其灵敏度是普通PCR方法的10倍；实时荧光法是检测RPA扩增产物最为常见的方式。张启龙等[31]针对CDV保守N基因建立了CDV实时荧光RT-RPA检测方法，该方法特异性较好，检测下限为5.68×102拷贝/μL，敏感性高于常规RT-PCR方法，操作快速便捷，20 min内即可判读结果，可用于临床犬瘟热病例的快速诊断。Wang J C等[32]建立的CDV荧光RT-RP检测方法，40 ℃反应3 min～12 min即可，灵敏度比荧光定量PCR高10倍。侧流层析试纸条方法利用双抗体夹心法，可实现对RPA扩增产物的快速检测，研究人员将RPA扩增产物经侧流层析试纸条对沙门氏菌进行检测分析，检测结果可用肉眼直接观察，整个操作过程仅需要30 min，且检测限可以达到10 CFU/mL；目前，与微流控技术的结合研究也逐渐成为RPA技术研究的热点。

RPA技术与其他核酸检测方法相比具有一定的优势，但也存在一些缺点。应用琼脂糖凝集电泳方法检测RPA产物时，需要开管操作，易产生交叉污染；实时荧光RPA法与传统荧光PCR探针如TaqMan不兼容，且至今没有专门针对RPA引物探针的设计软件，需要大量合成和筛选，且需要昂贵的实时荧光检测仪器；侧流层析试纸条技术虽然实现了RPA 产物的可视化检测，但开管操作易发生污染，因此，目前还需要不断创新RPA检测技术，与其他技术的有效结合也需要进一步去扩展，探索开发一种简便的闭管可视化RPA检测方法将更有利于RPA技术应用于兽医临床现场CDV的快速诊断。

4.4 其他检测方法

虽然荧光定量PCR、LAMP和RPA等检测方法具有特异性好、灵敏度高等优点，但是无法满足多种病毒平行检测的需求。苏霞等[33]以CDV、犬细小病毒、犬腺病毒Ⅰ型、犬腺病毒Ⅱ型、犬冠状病毒这5种犬腹泻病毒为靶病毒，选取各病毒基因序列的保守区域设计引物，并针对每种病毒的变异区域设计探针，通过优化检测体系和反应条件，建立了可同时区分5种病毒的基因芯片诊断方法，可对临床中犬类混合感染样品进行检测，对病毒检测和筛查具有重要作用。研究人员建立的犬瘟热病毒抗体液相芯片检测方法，具有特异性强，敏感性强，重复性好和检测范围广的特点，能够定性分析血清样品中的多种病原抗体。苏瑞红等[34]以红色聚苯乙烯纳米微球为载体，建立了快速检测幼犬CDV母源抗体或免疫犬抗体水平的间接凝集试验，该方法具有良好的特异性、敏感性及稳定性，可用于CDV抗体的快速检测。马志华[35]建立了犬瘟热假病毒中和抗体检测方法，该方法与传统中和试验具有良好的相关性和一致性，其检测周期相比传统中和试验可缩短2 d，且生物安全性高。

5 结语

犬瘟热发病率高，传染性强，是严重威胁犬及毛皮动物健康的重要传染病之一。因此，开发特异、快速和灵敏的检测技术，进行CDV早期检测，可有效防止疫病的传播流行。目前，研究人员已研发出多种CDV检测方法，但每种方法都存在自身优势和不足之处。病毒分离和包涵体检测步骤繁琐且费时，不利于快速诊断；电镜观察需要昂贵仪器，不易在兽医临床推广应用。中和试验适用于动物疫苗免疫后的血清抗体水平检测，无法用于急性感染诊断。ELISA方法特异性和灵敏性较高，但步骤繁琐、成本高，可作为样品筛查和其他检测方法阳性样品的确认和复查。目前被宠物医院等临床工作者广泛使用的胶体金免疫层析技术具有操作简单、速度快、检测结果易判断的优点，常用于CDV感染样品的初筛和基层实验室筛查，但该方法还存在灵敏度和重复性差、准确性不高和无法定量的问题[36]。实时荧光定量PCR方法需要昂贵的仪器设备，难以应用于临床检测；LAMP方法易出现假阳性和气溶胶污染等问题；实时荧光RT-RPA方法核酸探针设计技术含量高。因此，在进行样品检测时可将多种检测方法相结合，最大限度提高检测的准确率、特异性和敏感性。推进新型快速诊断技术的研发，促使实验室和临床检测技术不断创新，检测手段不断成熟和完善，将会有更多快速、灵敏、高特异性、低成本的检测技术能够满足CDV实验室和临床检测需求的检测方法。