具核梭杆菌促进结直肠癌发生机理的研究进展

2022-11-25张艳芳潘耀谦刘兴友

动物医学进展 2022年1期

张艳芳，李鹏，潘耀谦*，刘兴友*

(1.河南师范大学生命科学学院，河南新乡 453007； 2.新乡学院生命科学和基础医学学院,河南新乡 453003)

结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是人类消化道常见的致命性恶性肿瘤，在全球发病率很高，死亡率位列恶性肿瘤的第3位，每年因CRC死亡的人数高达50万，对人类健康的危害很大[1]。导致CRC发生的病因很多，但近年来越来越多的研究发现，肠道微生态改变，特别是菌群失调在CRC发生和发展中起到重要作用[2-4]。人类肠道有一个数量庞大、结构复杂的微生态系统，包括细菌、真菌、病毒和寄生虫等，其中细菌占据主要地位，约有1 000余种。据报道，成人肠道系统中至少有100万亿个微生物，质量约为1.5 kg，是人体细胞总数的10倍，其编码的基因数目是人类基因的150倍。这些微生物群与肠道黏膜免疫系统等组成复杂的肠道微生态。一旦微生态平衡被打破，就会引起肠道疾病和肿瘤的发生。近年来[5-7]，通过基因组序列检测、宏基因组学及高通量测序技术运用，不仅发现结直肠癌患者的肠道微生态的破坏，肿瘤组织和周围正常组织的菌群存在很大差异(前者是后者的250倍，而CRC组织中的数量更是高达1 000倍以上)，而且还揭示具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)数量与CRC的发生有密切关系。最近的一些研究[8-10]证明，具核梭杆菌在改变的结直肠微生态中异常活跃，是诱发结直肠癌重要病因。迄今为止，具核梭杆菌促进CRC发生和发展的作用机理还不清楚。作者查阅了大量有关文献，就具核梭杆菌促进结直肠癌发生发展的机理做一综述。

1 具核梭杆菌对结肠和CRC组织固有免疫细胞的抑制作用

固有免疫(innate immunity)是机体在种系发育和进化过程中形成的一系列天然免疫防御功能，在启动及调节特异性免疫方面发挥重要作用，而且对机体的抗肿瘤免疫效应也起着不可忽视的作用。具核梭杆菌对固有免疫细胞具有较强的抑制作用[11]，从而影响了机体对CRC特异性免疫的形成。

1.1 具核梭杆菌对髓源性免疫细胞的影响

Kostic等在CRC小鼠模型中发现具核梭杆菌能增强肿瘤负荷、促炎标志物和髓系免疫细胞的浸润，特别是CD11b+细胞，包括树突状细胞(dendritic cells，DCs)、巨噬细胞和粒细胞。Castellarin等的研究表明，CD11b+骨髓细胞在促进肿瘤发展和血管生成中起关键作用。肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages，TAMs)可通过产生介质(如表皮生长因子和促血管生成素)等来促进肿瘤生长。灌注具核梭杆菌的小鼠在肿瘤微生态环境中增加了TAMs种群(是正常组织的7.8倍)，并导致对CD4+T细胞的抑制，影响了适应性免疫的产生。血管生成为肿瘤细胞提供氧气和营养物质，以促进其进一步生长和发展[12]。促进血管生成的条件有很多，比如缺氧。组织器官在缺氧的条件下[13]，缺氧诱导因子1 (hypoxia inducible factor 1,HIF 1))可增加血管生长因子的表达，包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptors,VEGFRs)。Mendes等的研究也获得了相同结果，即用具核梭杆菌感染上皮细胞通过上调VEGF和VEGFR1/2而增加血管生成。低氧和HIF1在肿瘤微生态环境中的另一作用与促进骨髓源性抑制细胞(myeloid derived suppressor cells，MDSCs)的形成有关，MDSCs在肿瘤中起免疫抑制细胞的作用[14]。已有研究表明，MDSCs可减少T细胞向肿瘤组织的浸润，阻止T细胞对CRC细胞的侵扰，并通过增加基质金属蛋白酶-9而增加血管生成和维持干细胞的特性。Toor等证明，灌注具核梭杆菌小鼠的MDSCs和肿瘤相关中性粒细胞(tumor associated neutrophils，TANs)的数量增多。MDSCs能生成高水平的诱导型一氧化氮合酶和精氨酸酶-1，表明它们可通过抑制T细胞而帮助癌细胞实现免疫逃避，而TANs也参与了肿瘤的发展、血管生成和转移。另外，给小鼠灌注具核梭杆菌改变了肠道微生态后，局部组织中增加的另一种髓系免疫细胞是CD103+调节性树突状细胞。这些细胞通过增强Foxp3+功能，而抑制T细胞的表达从而减弱了抗肿瘤免疫。

总之，具核梭杆菌通过改变结直肠的微生态环境，抑制各种髓源性免疫细胞的功能，促进结直肠癌的发生和发展，并通过抑制T细胞来干扰特异性免疫的形成。

1.2 具核梭杆菌对NK细胞的抑制作用

具核梭杆菌可通过抑制自然杀伤(natural killing，NK)细胞的细胞毒性作用来协助CRC细胞逃逸免疫杀伤[15-16]。NK细胞属于固有免疫系统，有2种受体类型,即激活受体和抑制受体。激活受体可以与肿瘤蛋白、病毒成分、自身分子和应激诱导分子结合，并将之消除。而抑制受体则导致NK细胞功能降低。T细胞免疫球蛋白及免疫受体酪氨酸抑制基序(T cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif [ITIM] domain，TIGIT)是一种作用于NK细胞等免疫细胞的抑制性受体，与配体结合后可通过细胞质域、ITIM和免疫受体尾部酪氨酸样基序启动对信号的抑制，使NK细胞活性降低。研究表明[17]，具核梭杆菌与人的TIGIT (hTIGIT)受体在NK细胞上相互作用，可启动抑制性级联反应。从CRC患者组织中分离的带有具核梭杆菌的细胞，经培养证明具核梭杆菌通过激活hTIGIT来抑制NK细胞。

2 具核梭杆菌特异性毒性因子对CRC发生的影响

具核梭杆菌的毒性因子可通过调整结直肠的微生态或改变细胞的信号通路，使细胞转化或突变，进而出现癌变倾向、免疫逃避和癌变。具核梭杆菌可以产生3种特异性毒性因子，即侵袭细胞的梭杆菌黏附素A(Fusobacteriumadhesin A，FadA)、毒害细胞的凝集素，即梭杆菌自动转动蛋白2(Fusobacteriumautotransporter protein 2，Fap2)和外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMVs)。这3种毒力因子可相互作用于肠上皮细胞，并在其他一些因素的参与下，导致肠上皮细胞突变和肿瘤形成。

2.1 黏附素FadA的毒性作用

FadA毒力因子既可协助具核梭杆菌对肠上皮或CRC细胞的黏附和侵害，又能激活细胞的Wnt/β-catenin信号通路，从而促进肠上皮突变。Sun G H等[6,9,11]发现了具核梭杆菌的FadA毒力因子，有利于其黏附和侵入包括CRC细胞在内的上皮细胞和内皮细胞，加速了CRC患者肠上皮细胞的细菌性癌变。FadA是具核梭杆菌产生的高度保守的毒力因子，主要以两种形式存在，即前体非分泌型FadA(pre-FadA)和成熟的分泌型FadA(mFadA)。pre-FadA定位于内膜中，只能溶于酸性胞质中，而mFadA主要存在于菌体胞膜表面，可溶于酸性和中性胞质中。当pre-FadA和mFadA在中性胞质中彼此分开时，它们呈失活状态，并不表达功能。一旦胞质变成酸性时两者即可结合在一起，形成FadA复合物(FadAc)。FadAc具有强烈的活性，是具核梭杆菌黏附和侵入宿主上皮细胞并表达功能的活性毒力因子。

据认为[18]，具核梭杆菌通过其菌膜上的FadA与宿主肠上皮细胞接触，激活了上皮细胞的经典Wnt/β-catenin信号通路，从而诱导肿瘤的发生和发展。Wnt/β-catenin信号转导通路是一条在生物进化中极为保守的通路。在健康人的上皮细胞中，β-catenin只是作为一种细胞骨架蛋白，在胞膜处与钙黏附蛋白(E-cadherin)形成复合体，借以维持同型细胞的特性，防止细胞的移动和变态。只有当细胞外Wnt信号分子及其配体与细胞膜上特异性受体结合后，才能启动Wnt/β-catenin信号通路。业已发现在具核梭杆菌阳性CRC组织中不仅Wnt及其物质过量表达，而且显示出更高水平的β-catenin。据认为[19]，FadA具有Wnt信号分子配体的作用。当FadA激活Wnt信号分子并与细胞膜上的特异性受体卷曲蛋白(Frizzled，Frz)结合后，即可激活Wnt/β-catenin信号通路，使其下游靶基因，如 c-myc、cyclin D1和WISP等转录，导致细胞的增殖、分化和突变。在这一通路中具有两种至关重要的致癌基因，即c-myc和cyclin D1，它们都有相关的下游效应，均能有力地促进癌细胞的生存与发展。c-myc能诱导哺乳动物上皮细胞形态变化，增强细胞的非锚定依赖生长能力;而Cyclin D1在从G0/G1期到S期的转变中发挥重要作用，在许多癌症中均呈现上调。研究表明，CRC患者中cyclin D1癌基因表达增加[20]，其过表达与CRC患者的预后不良有关。此外，在人类结肠癌和正常邻近组织标本中，CRC患者fadA基因表达升高。因此，有人认为FadA基因表达水平有望成为结肠癌诊断和预后判断的参考指标。

2.2 凝集素Fap2的毒性作用

Fap2主要通过两种方式对宿主细胞产生毒害作用，一是通过凝集作用使具核梭杆菌与上皮细胞结合，导致上皮细胞损伤或突变；二是抑制固有免疫细胞的活性，发挥具核梭杆菌致病作用。研究发现[1-2,6]具核梭杆菌产生的Fap2蛋白通过与CRC中过表达的D-半乳糖-β(1，3)-N-乙酰-D-半乳糖胺(D-galactose-β(1,3) -N-acetyl-D-galactosamine,Gal-GalNAc)结合，在介导CRC中的细菌富集和细胞的突变过程中发挥着重要作用。为了证实这一发现，他们用O-glycanase抑制Gal-GalNAc的表达，从而减轻具核梭杆菌在CRC中的积累。Casasanta M A等[21]证明Fap2可介导具核梭杆菌与小鼠CRC细胞特异性结合，并且Gal-GalNAc在CRC细胞中呈高水平表达。如果抑制Fap2或宿主上皮Gal-GalNAc的表达则可阻止具核梭杆菌诱发的CRC形成。总之，Fap2是具核梭杆菌产生的可与上皮细胞生成的Gal-GalNAc相互识别的特异性凝集素，能够引起具核梭杆菌与CRC中过表达的Gal-GalNAc特异性结合。另外，产生Fap2的具核梭杆菌还可通过血液循环进入结直肠，定植在肠上皮或肿瘤上，改变其微生态环境，从而引起上皮的突变或促进肿瘤的发展。

另外，具核梭杆菌的Fap2还能与TIGIT分子结合，抑制适应性免疫的产生。研究证明，除NK细胞外，其他肿瘤浸润的淋巴细胞，包括CD4+和CD8+T细胞，均表达TIGIT受体。Gur等曾证明具核梭杆菌通过Fap2介导的TIGIT相互作用，可抑制T辅助细胞和细胞毒性T淋巴细胞。具核梭杆菌抑制蛋白可使人的T细胞在细胞周期的G1期发生阻滞。具核梭杆菌这种从不同的方面抑制具有特异性免疫作用细胞的活性，干扰了适应性免疫的产生，从而有利于癌细胞的分化，生长，并能促进癌细胞的转移。

2.3 外膜囊的毒性作用

众所周知[22]，革兰氏阴性细菌能够分泌一种毒性因子的传递系统，即OMVs。具核梭杆菌表面的蛋白和FadA可促进OMVs与宿主上皮细胞相互作用，并借助OMVs内蛋白酶来降解肠上皮细胞膜的E-cadherin。E-cadherin是一种紧密连接蛋白，可促进细菌入侵和诱导炎症反应。此外，来自具核梭杆菌的OMVs还可诱导上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，成为肿瘤转移的一个主要途径。具核梭杆菌和OMVs都能上调EMT标记物，包括E-cadherin、整合素抑制因子(integrin inhibitor )、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)和纤连蛋白1(fibronectin-1)。Yan等也证明在带有EMT标记物和肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)标记的CRC Ⅲ/Ⅳ期患者之间，具核梭杆菌水平呈现正相关，并认为具核梭杆菌可能在EMT- CSCs交互过程中促进CRC的发展。另外，Melinda A等[23]证明，具核梭杆菌的OMVs还有促进IL-8和TNF的分泌，具有诱导炎性反应的作用。

3 具核梭杆菌的促癌性miRNA形成

研究证明[24-25],在APCmin/+小鼠模型试验中发现具核梭杆菌感染CRC细胞后，激活核转录因子-κB(NF-κB)信号通路，导致miRNA21 表达增加，而该miRNA可以增强CRC细胞的侵袭活性并形成异种移植肿瘤。该临床研究显示，肿瘤组织中同时具有大量具核梭杆菌DNA和miRNA21患者的预后较差。Hur K等[26]证明有多种miRNAs在CRC的肿瘤发生中发挥作用，其中一些还被用作CRC诊断和进展的生物标志物。Shi等证明miRNA 21在肠道慢性炎症和结肠炎相关CRC的进展中发挥重要作用。Yang Y等[24]在体内外研究了具核梭杆菌在CRC进展中的作用及其机制，报道了用具核梭杆菌对CRC细胞株的处理，增加了细胞的增殖和侵袭，而具核梭杆菌对APCMin/+小鼠的作用则增加了肿瘤数量、肿瘤负荷和肿瘤大小。用具核梭杆菌处理CRC细胞株后，芯片分析显示657个miRNAs中，有50个miRNAs上调，52个miRNAs下调，其中miRNA 21表达率最高。因此，miRNA 21被认为是与具核梭杆菌诱发CRC的miRNA，有可能成为检测CRC的标志。

另外，进一步的调查显示[27]，RASA1属于RAS GTPase激活蛋白家族，是miRNA 21的直接靶标，抑制miRNA 21可增加RASA1表达。RASA1可以与RAS癌蛋白结合并使其失活。因此，miRNA 21可能是具核梭杆菌促进生成的有助瘤生长的miRNA。Yang Y等[24]提出了具核梭杆菌可以激活肠上细胞TLR4/MYD88/NF-κB信号通路，借以调节miRNA 21的表达。

4 具核梭杆菌性促炎因子对CRC细胞的影响

据Nasser H G等[16,28-29]报道，具核梭杆菌与其他引起肠道肿瘤相关的细菌不同，它不能直接引起肠管的炎性反应，不会加剧结肠炎、肠炎或炎症相关的肠道病变，但由它刺激产生的促炎因子却可以加速肿瘤的发生。暴露于具核梭杆菌的ApcMin/+小鼠的肿瘤，表现出与人类具核梭杆菌阳性结直肠癌相同的促炎表达特征。然而，在这些小鼠中没有观察到任何肠炎的变化。受试的ApcMin/+小鼠在没有任何肠炎或肉眼炎症的情况下，具核梭杆菌则能加速肿瘤的发生。

Yang Y等[24]研究表明炎症因子有助于CRC的发展。根据他们对感染具核梭杆菌小鼠的血清分析，包括 IL-17F、IL-21、IL-22和巨噬细胞炎症蛋白3 α(macrophage inflammatory protein 3 alpha，MIP3α)在内的炎症因子呈上调状态。IL-17F、IL-21和IL-22是TH-17细胞的主要细胞因子，在肿瘤发生中具有双重作用。Jiang等曾报道IL-17F、IL-21和IL-22在患CRC病人体内呈现高表达状态，但在特定条件下，这些因素可发挥抗肿瘤作用。例如，IL-17F可以抑制促血管生成因子，包括VEGF和前列腺素E2。这些有争议的影响可能是这些促炎因子由不同类型的细胞产生的。Rezasoltani S等[24,30]认为TLR识别配体后可通过接头蛋白传递细胞内的信号，激活 NF-κB 和MAPK途径[31]，诱导炎症因子(TNFα、IL-1β、IL-6、IL-12)、血管生成因子、生长因子，细胞黏附分子和基质降解酶的表达，促进肿瘤的发生、发展。具核梭杆菌产物和髓样细胞 TLR 结合，促进炎性因子IL-1、IL-6、IL-22和IL-23的释放，而IL-23能活化下游TH-17细胞[32]，后者分泌的IL-17和IL-22可活化信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription，STAT3)，激活的STAT3可以调节VEGF的表达，加速肿瘤血管的形成，促进肿瘤细胞的增殖与侵袭。