玉米赤霉烯酮检测方法研究现状

魏 振，王秋玲，石继超，龙 淼 *

(1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110866；2.明康汇生态农业集团，安徽明光 239462；3.辽宁省农业发展服务中心，辽宁沈阳 110001)

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)又称F-2毒素，是一种由镰刀菌产生的非甾体类真菌毒素，常存在于受镰刀菌污染的谷物中(小麦、玉米、燕麦和大麦等)。ZEN的污染对于农产品的质量和食品安全有很大的影响，食用受ZEN污染的饲料的动物会受到肿瘤、雌激素和免疫抑制作用的不利影响，这些过度或持续性的作用会导致体重减轻，并增加由免疫抑制和生殖障碍引起的疾病发展[1]。真菌毒素是真菌的天然次生代谢产物，估计约25%的相关食品受到真菌毒素的污染，这些真菌落在谷物上，会在收获前的田地中或收获后不适当的储藏条件下有真菌污染而产生并积累的[2-3]。如果这些受污染的谷物商品进行贸易，就有助于ZEN在全球的扩散。

Zhou Y等[4]通过研究表明，ZEN不止影响雌性的生殖能力，还会影响到其后代的生殖能力；使雄性F1后代的精液质量和精子数量明显下降，畸形率显著增加，睾丸激素水平显著降低。王宗捷等[5]通过试验得出ZEN呈剂量依赖性抑制了山羊子宫内膜基质细胞的增殖，并且随着ZEN剂量的增加细胞的凋亡比例明显上升，通过对细胞内质网应激(ERS)通路相关分子和蛋白表达量的研究表明，ZEN是通过ERS通路来调控山羊子宫内膜基质细胞的凋亡进程。Cai G D等[6]从小鼠原代脾淋巴细胞中分离出T淋巴细胞，经伴刀豆球蛋白激活后，接触不同浓度的ZEN可降低激活的T淋巴细胞活力，可以使T淋巴细胞胞内和表面超微结构损伤，抑制了CD25和CD278的表达，从而抑制了效应分子孔蛋白(poreforming protein，PFP)、颗粒酶A(granzyme A，GZMA)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的合成，同时促进T淋巴细胞凋亡，并且伴有MAPK通路的过度激活，这说明ZEN能通过诱导MAPK通路的激活促进T淋巴细胞凋亡。

动物在食用受ZEN污染的饲料后，不仅会降低动物的生殖能力、生产力、免疫力，而且ZEN还能残留在动物的组织中对人体健康产生危害[7]。大部分的玉米赤霉烯酮类化合物能够通过尿液和粪便排出体外，但也有一小部分通过乳汁排出[8]。ZEN污染严重、波及范围广阔，无论是对人的健康还是动物的健康都有严重的影响，所以对谷物、动物性食品、动物饲料原料及饲料成品进行ZEN的检测极为重要。

1 国内外对ZEN检测限量

我国《饲料卫生标准》(GB 13078.2-2006)要求，配合饲料、玉米中的ZEN含量不超过500 μg/kg。我国修订的《饲料卫生标准》(GB 13078-2017)要求，青年母猪、仔猪配合饲料中ZEN的限量为100 μg/kg和150 μg/kg，饲料原料中ZEN限量在0.5 mg/kg～1.5 mg/kg之间。食品添加剂联合专家委员会(Joint expert committee on food additives，JECFA)已将ZEN的最大可耐受日摄入量(TDI)定为0.5 μg/kg体重，而欧洲食品安全局(European food safety agency，EFSA)已将该数字降至0.025 μg/kg体重[9]。欧盟法规856/2005已将婴儿食品中ZEN的最高残留量设定为20 μg/kg[10]。国内外对于ZEN的限量越来越严格，研制较为迅速、准确的检测方法应用到实际生产中具有重要意义。

2 检测方法

2.1 免疫分析法

Yin M Q等[11]以胶体金和广谱单克隆抗体为基础，结合玉米赤霉醇及其5种类似物，建立了一种竞争性的流式免疫分析(lateral flow immunochromatographic assay，LFIA)，用来专门测定家畜体内生长促进剂玉米赤霉醇的残留量，该方法可以在10 min内得到结果，能做到快速、同时半定量、定量检测牛乳中玉米赤霉醇及其5种类似物的残留量。另外，利用这种方法测试了其他真菌毒素和生长促进剂，结果表明试纸条的灵敏度非常高，没有出现交叉反应，说明该测试条具有高度的特异性。Wang J N等[12]针对ZEN设计了一种基于ssCo3O4的高灵敏度阻抗免疫分析方法，可启动信号放大，阻抗信号随着ZEN浓度对数的增加而增加，该免疫测定法对ZEN具有很高的敏感性，阻抗信号在0.1 fg/mL～10 pg/mL范围内随ZEN浓度的对数呈线性增加，检出限为3.30×10-14mg/mL。通过多巴胺(DA)在AuNPs表面的氧化自聚合反应，合成了聚多巴胺涂层金纳米颗粒(Au@PDAs)，Xu S L等[13]首次提出将其作为玉米中ZEN的LFIA检测的信号放大标签，通过LFIA检测，检出限为7.4 pg/mL，该方法中聚多巴胺层以适当的厚度涂覆在金纳米颗粒上之后，聚多巴胺涂层金纳米颗粒变得更稳定地分散在溶液中并且不容易聚集，而且其颜色强度也比金纳米颗粒的颜色强度强，用于LFIA中可以提高灵敏度。Li M等[14]研发了磁珠免疫分析偶联生物素-链霉亲和素系统(BAS-MBI)，该方法的检测限为0.098 ng/mL，工作缓冲液的最大半数抑制浓度为0.71 ng/mL，检测限为0.98 ng/g，农业样品检测范围为0.98 ng/g～51.6 ng/g，结果表明BAS-MBI是一种快速、灵敏、特异和准确用来测定ZEN的有效方法。

免疫色谱分析(immunochromatographic analysis，ICA)是生物分析方法中最常用、最成熟的免疫分析法，它具有快速、特异性好、高通量、方便、低成本等特点，由于其可独立于实验室且具有成本效益的免疫分析方法，ICA非常适合于不同基质的现场检测，但是传统的免疫分析法通常只对样品中的单一目标分析物进行检测，无法实现对多个目标分析物的同时检测，所以，能建立一种同时检测同一样品中的多个目标分析物且具有省时、低成本和高通量筛选的优势免疫分析法具有重要的意义[15]。Xu Y等[16]建立了一种基于纳米铕(europium nanoparticles,EuNPs)的双荧光免疫层析法(DF-ICA)，用于同时检测玉米样品中的橘霉素(citrinin，CIT)和ZEN。优化后，同时测定CIT和ZEN的检出限为0.06 ng/mL和0.11 ng/mL，半数抑制浓度为0.35 ng/mL和0.76 ng/mL，加标回收率分别为86.3%～111.6%和86.6%～114.4%。Sun S J等[17]成功开发了一种时间分辨荧光免疫色谱分析法(TRFICA)，用于中草药中黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)和ZEN同时定性和定量检测。该方法中具有独特光学特性的Eu-纳米球(EuNPs)提高了免疫色谱分析的稳定性和灵敏度。在最佳条件下，已建立的TRFICA对于AFB1的线性范围为0.60 μg/kg～3.92 μg/kg，ZEN的线性范围为0.40 μg/kg～1.28 μg/kg。结果证明该方法是一种同时快速、灵敏的定量检测真菌毒素的方法。

2.2 分子印迹固相萃取

分子印迹技术是采用人工方法，针对待测分子(模板分子)所带的官能团和空间结构，利用有机化合物(功能单体)和交联剂的物理和化学性质制备与待测分子专一性结合，含有特定空间结构孔穴的分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymer，MIP)的技术[18]。MIP具有预定性、特异识别性、实用性、良好稳定性等特点，因此在食品安全检测领域得到广泛的应用[19]。

Zhang Y等[20]以2，4，6-三丙烯酰胺基-3，5-三嗪(TAT)为功能单体成功合成出新型磁性表面分子印迹聚合物，并将其用于ZEN的富集和测定中，首次报道了ZEN在小麦中的分子印迹。该方法对ZEN的检出限量为0.55 ng/g，回收率为92.1%～96.0%，相对标准偏差低于5.4%，成功地应用于加标小麦样品中。Nolan P等以金属有机骨架MIL-101为支撑核，香豆素-3-羧酸为ZEN的假模板，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸羟乙酯为交联剂合成印迹聚合物(MIL-101@MIPs)，以该聚合物作为固相萃取柱的吸附剂进行样品制备，用高效液相色谱-荧光检测系统监测洗脱。该方法的线性范围为6.25 ng/kg～250 ng/kg，检出限为2.09 ng/kg～4.16 ng/kg，定量限为6.25 ng/kg～12.50 ng/kg，加标回收率在81.70%～90.10%之间，相对标准偏差小于5.56%[21]。Shao M Y等[22]描述了一种环保、高效的一步法合成包裹分子印迹荧光淬灭颗粒(MIFQP)的碳量子点及其在谷物样品中ZEN测定中的应用研究，经验证，这些荧光淬灭材料对ZEN的检测范围为0.02 mg/L～1.0 mg/L，检测极限为0.02 mg/L。最后，MIFQP成功应用于玉米中的ZEN测定，回收率从78%提升至105%，相对标准偏差低于20%，这表明它在实际应用中具有很大潜力。

2.3 QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱

QuEChERS是快速(quick)、简单(easy)、廉价(cheap)、有效(effective)、稳定(rugged)、安全(safe)的简称，是由美国农业部Anastassiades等于2003年提出的样品前处理方法[23]。

Nualkaw K等[24]建立了一种简单的基于QuEChERS的方法加入稳定同位素稀释(13C-ISTD)，再通过超高效液相色谱-串联质谱法同时测定猪，家禽和奶制品中的17种霉菌毒素。平均回收率准确度在70%～120%范围内，精密测试的相对标准偏差≤20%，检测极限和定量极限分别为0.25 ng/g～40.0 ng/g和0.5 ng/g～100.0 ng/g。Choukri K M等[25]采用了基于QuEChERS的萃取和超高效液相色谱-串联质谱联用技术，对阿尔及利亚市场上的120份谷物样品进行了检测，发现其可以同时检测出多种真菌毒素。Facorro R等[26]基于(d)固相萃取和QuEChERS提取物组合的样品前处理方法，结合液相色谱-高分辨率质谱同时测定20个奶牛场混合饲料中的26种真菌毒素，分析的所有样本均显示出2种或多种真菌毒素同时存在，其中ZEN、伏马菌素B1和β-玉米赤霉烯醇反复出现，发生频率为60%～90%。Rausch A K等[27]使用QuEChERS的提取方法，然后在不同条件下进行两次高效液相色谱串联质谱进行分析，得出谷物中相关的真菌毒素，定量限为0.05 μg/kg～150 μg/kg。该方法对大多数真菌毒素均具有良好的线性(R2> 0.99)，回收率(61%～120%)，可重复性(RSDr<15%)和再现性(RSDR<20%)。

2.4 生物传感器

基于生物传感器的ZEN检测方法具有高灵敏、强特异性的特点，是近年来新兴的有效检测手段，作为ZEN检测的前景替代方法，生物传感器技术具有高专一性、高选择性、便携性以及实时分析的性能，具有可观的发展前景[28]。

Nolan P等研究出一种质量敏感微阵列生物传感器，它由4×16个微型质量敏感传感器像素组成，基于固体安装谐振器技术，可以利用纳米点斑技术对传感器表面单个像素进行功能化处理，同时半定量检测3种受调控的霉菌毒素T2毒素、ZEN和伏马菌素B1(fumonisins，FumB1)。通过使用便携式微流控设备对T2毒素、ZEN和FumB1进行单次检测的灵敏度分别为1.3 ng/mL、6.8 ng/mL和2.0 ng/mL；对T2毒素、FumB1和ZEN的多重检测灵敏度分别为6.1 ng/mL、3.6 ng/mL和2.4 ng/mL[29]。Chen Y F等[30]开发了一种基于大肠埃希氏菌的灵敏、方便的电化学生物传感器，用于真菌毒素ZEN的毒性检测。这是首次将大肠埃希氏菌用作检测真菌毒素的识别元件。生物传感器设计采用了两步反应策略，以消除介质、分析物和缓冲液的相互干扰。上述生物传感器在标准样品检测中显示出良好的灵敏度，并且在实际油样分析中显示出优异的准确性，检出限为6 ng/mL，线性范围0.05 μg/mL～0.5 μg/mL。Wei T等[31]使用基于自组装单层膜的SPR传感器芯片建立了表面等离子体共振(SPR)方法。结果显示AFB1、曲霉毒素A、ZEN和脱氧炔诺醇的最低检出限分别为0.59 ng/mL、1.27 ng/mL、7.07 ng/mL和3.26 ng/mL。将测试数据与HPLC-MS/MS确证分析结果进行了比较，两者之间具有很好的一致性。结果表明，该方法具有高灵敏度、高线性和特异性，可同时检测4种真菌毒素，可以满足谷物食品的检测要求。

2.5 其他

Yin N等[32]建立了无酶荧光测定法用于测定ZEN，该方法结合了催化的发夹装配(CHA)，接近银纳米簇(Ag NCs)的超高荧光发光富含G的DNA序列，以及使用适体(Apt)。在ZEN存在下，抑制序列(Inh)通过ZEN与Apt-T的适体的结合而从触发适体序列(Apt-T)释放。自由的Apt-T充当一个开关，可打开发夹H1和H2生成H1-H2复合物。已释放的Apt-T可用于触发H1和H2之间的下一轮CHA。最后，H1与Ag NCs探针(P)之间的杂交使富含G的序列与P包裹的深色Ag NC紧密相邻。这导致Ag NC的高效发光和在575 nm/628 nm处具有激发/发射峰的放大荧光的产生。在优化条件下，可观察到浓度为1.3 pg/mL～100 ng/mL的线性相关，检出限为0.32 pg/mL。Xu J H等提出了一种新的金纳米粒子在适配体官能化的杂化亲和整体柱上，并用于通过液相色谱仪在线特异性识别ZEN。适体的超高覆盖密度可以达到3 636 pmol/μL，对于获得高特异性、低干扰的共存物质的ZEN的有效分析，对ZEN的灵敏识别具有最低检测限0.05 ng/mL。Ji X D等[34]首先合成出一种新型的纳米金属-有机配位聚合物纳米载体(3D樱花形铜离子(Ⅱ)@ L-谷氨酸(L-Glu))，3D樱花形Cu@L-Glu与钯-铂纳米粒子(Pd-PtNPs)结合后获得的Cu@L-Glu /Pd-PtNPs可作为信号标签，用于ZEN的超灵敏检测，检测限为0.45 fg/mL。Chen Y等[35]开发出一种基于高灵敏度量子点的荧光猝灭侧向流动测定，用于ZEN的灵敏检测。ZEN的荧光淬灭侧向流动测定的线性检测范围在0.78 ng/mL～25 ng/mL之间，检出限为0.58 ng/mL。此外，荧光淬灭侧向流动测定显示出高的回收率(83.1%～93.6%)，可用于检测出掺入玉米样品中的ZEN浓度。

3 展望

对于研究出新型的ZEN检测方法具有可观的发展前景。目前的检测方法虽然能够通过精密的仪器和精准的检测技术准确定量出目标物质的含量，但是检测所用的设备较为昂贵，推广难度较大；检测的费用较高，需要专业操作人员；样品的前期处理时间长、步骤繁琐，不能进行现场的快速检测。而目前的快速检测方法虽然能够实现现场的快速检测，但是反应的灵敏度低，结果的准确度低、假阳性率高，达不到准确分析和检测的目的，所以仍然需要高灵敏度、高准确性、操作简便快捷、能够达到实时分析和低费用要求的检测方法。为了能更好地守护人类及动物的健康，对于检测方法的创新和优化就是重中之重。