牛冠状病毒研究进展

2022-11-25沈思思冯万宇兰世捷黄宝银刘德会史同瑞

动物医学进展 2022年1期

沈思思，陈亮，冯万宇，兰世捷，李丹，苗艳，张蕾，黄宝银，王欢，刘文，刘德会，史同瑞

(黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江齐齐哈尔 161000)

冠状病毒(Coronavirus，CoV)是一种严重危害人类和动物健康的病原，主要引起宿主的呼吸道和消化道感染。继2003年的严重急性呼吸综合征病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)和2012年的中东呼吸综合征病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)之后，2019年由SARS-CoV-2引起的人类群体性肺炎——新型冠状病毒肺炎(Coronavirus disease 19,COVID-19)，又将冠状病毒重新引入大众视野[1-2]。这3种冠状病毒的共同特点是由动物传播到人类，并且严重威胁人类健康，给世界各国造成巨大的危害。牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)与1967年首次分离的人类冠状病毒OC43(Human coronavirus OC43,HCoV-OC43)高度相似，核苷酸同源性为96%[3]。1988年，从德国一名儿童的腹泻样本中分离出1种命名为HEC4408的冠状病毒毒株，其基因组显示该毒株与BCoV的关系比其他人类冠状病毒关系更加密切，说明该毒株可能来源于BCoV[4]。这些都提示BCoV和人类冠状病毒之间有跨越物种传播的可能。本文从BCoV的基因组结构、流行病学、发病机制、临床症状、诊断、治疗和预防等方面进行综述，以期为BCoV的进一步研究提供考。

1 基因组结构

BCoV属于冠状病毒科、β冠状病毒属。基因组为一个约31 kb的单股正链RNA病毒，包括10个开放阅读框(open reading frames,ORFs)，两端是5′和3′非翻译区域。ORF1编码多聚蛋白pp1a，通过核糖体转移为pp1ab，然后被蛋白酶水解成多个非结构蛋白(nonstructural protein,NSP)。ORF3、ORF4、ORF8、ORF9和ORF10分别编码血凝素酯酶蛋白(hemagglutinin protein,HE)、刺突糖蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)，它们是病毒粒子的组成部分，其余的ORFs编码额外的NSPs，如32 ku和12 ku，对其功能未有深入研究[5]。

在冠状病毒中研究最多的是S蛋白，属于Ⅰ类病毒融合蛋白，在病毒入胞和致病作用中起着重要的作用。S蛋白分裂为S1(N端)和S2(C端)亚基。S1亚基负责病毒与宿主细胞受体结合、中和抗体诱导和血凝素活性。S1亚基内的氨基酸突变反映了病毒抗原性和致病性的变化，S1核苷酸序列常用于系统发育研究和分子流行病学调查。S2亚基为跨膜蛋白，在病毒侵袭过程中介导病毒和细胞膜融合[6]。

BCoV有一种独特基因编码的表面血凝素酯酶(HE)蛋白，在其他冠状病毒未曾发现。HE蛋白能诱导产生抗BCoV的中和抗体[7]。HE蛋白包含2个重要的功能结构域凝集素结构域和酯酶结构域。凝集素结构域识别细胞内的糖受体，而酯酶结构域可以破坏受体的酶活性，能够从目标细胞表面移除细胞受体。受体结合(凝集素)和受体破坏(酯酶)区域对病毒的入胞有重要影响。因此，除了S蛋白外，HE蛋白还充当了感染起始的第二种病毒附着蛋白的角色[8]。

2 流行病学

BCoV是引起新生犊牛腹泻、冬季痢疾和牛呼吸道感染的重要病原之一。冬季痢疾通常发生在较冷的地区，但最新研究显示在较暖的季节和热带地方也曾发生该病，如韩国的夏季，以及泰国、巴西和古巴等[9]。牛感染BCoV可导致幼畜死亡、生长迟缓、产奶量减少和奶品质降低，给养牛业造成严重的经济损失。除了感染牛外，BCoV也可以感染野生反刍动物，如驯鹿、非洲大羚羊、麋鹿、羊驼和长颈鹿等[10]。

根据临床症状，可将BCoV引起的疾病可分为肠道型和呼吸道型。BCoV感染途径是粪-口或气溶胶等传播，感染牛是主要的传染源[11]。研究表明，病毒在亚临床感染的成年牛体内可持续存在[12]。BCoV分离株在系统进化树中的聚类并不取决于它们是肠道型还是呼吸道型，而是取决于样本的地理来源[7]。在加拿大冠状病毒呼吸道分离株魁北克BCG-3994就与加拿大肠道分离株在同一分支[12]。BCoV只有一种血清型，可以用分子生物学和血清学等方法进行鉴别。

BCoV在世界各地广泛存在[14]。挪威的研究表明，2009年，BCoV在牛群中的血清阳性率分别为39.3%和80.7%；2016年，牛群中检测的血清阳性率为72.2%[15]。意大利在2006年期间，4次呼吸道疾病暴发均与BCoV有关，但未同时发现其他呼吸道病原体，并且其中的2次在肠道也检测到了BCoV[13]，说明感染的犊牛可在肠道和呼吸道同时携带BCoV。比利时30%的犊牛中检测到BCoV的血清转化。在爱尔兰(2008年-2012年)的一项回顾性研究中，BCoV是呼吸道疾病暴发时牛鼻拭子中最常见的病毒[16]。法国的两项独立研究收集的呼吸样本中检测到BCoV的概率为17%～63%。2020年，谭烁等[17]报道了新疆和辽宁地区的16个奶牛场153份奶牛腹泻粪便样本中检测到的BCoV阳性率为71.24%，场阳性率达100%。综上所述，BCoV具有较高的流行性和广泛的传播范围。

3 发病机制

BCoV通过S蛋白与宿主细胞膜受体结合进入细胞。最开始复制发生在呼吸道(鼻甲、气管和肺)，还是胃肠道(肠上皮细胞)仍然是一个具有争议性的问题。一方面，最初的复制是发生在呼吸道，大量的病毒被黏液保护，然后被吞下，感染肠道[18]。而另一面，胃肠道是首先被感染的，病毒以病毒血症进入的呼吸道。BCoV可以感染整个胃肠道，从十二指肠开始向大肠扩散，引起绒毛萎缩等黏膜病变。在呼吸道，BCoV可以引起间质性肺炎和鼻甲、气管及肺的上皮损伤[19]。Kanno T等[20]的研究表明，病毒脱落可持续很长一段时间。用套式PCR检测结果表明，鼻分泌物中BCoV可持续存在932 d，粪便中BCoV可持续存在1 058 d。

4 临床症状

4.1 新生犊牛腹泻

新生犊牛腹泻能引起小肠绒毛发育迟缓，同时导致大肠的结肠嵴萎缩[9]。犊牛的日龄和免疫力决定了发病率和病死率[21]。被感染母牛所生的犊牛患腹泻的风险则更高[22]。新生犊牛对疾病的保护依赖于肠腔中存在的特异性初乳抗体。血清中的初乳抗体不是直接保护黏膜，而是取决于再分泌进入肠腔内的免疫球蛋白数量。只有肠腔中有大量初乳抗体，才能有效防止BCoV的感染。通过给怀孕母牛注射疫苗可以诱导初乳中产生抗体，供给犊牛被动免疫保护，有效的预防BCoV。病毒感染可引起犊牛出血性腹泻，大多数犊牛伴有黄色稀便、脱水、体温降低和精神沉郁等症状。患病犊牛食欲不振和电解质损失，可引起代谢性酸中毒和低血糖[23]。严重者还会引起发热、倒地不起和死亡等。一些犊牛还会伴有呼吸症状。大多数感染为3日龄～21日龄，潜伏期为1 d～7 d，临床症状持续3 d～6 d，犊牛通过粪便和鼻腔分泌物进行传播[24]。健康犊牛和患病犊牛均可检测到BCoV，在一项研究中，健康犊牛和腹泻犊牛的BCoV阳性率分别为13%(15/118)和2.3%(1/43)。据报道，与20年至30年前的犊牛感染情况相比，BCoV引起的腹泻流行率更高了[25]。

4.2 冬季痢疾

冬季痢疾(Winter dysentery，WD)的特点是成年牛突然腹泻。通常在冬季流行，由牛冠状病毒引起，冬季痢疾在世界各地的牛群中发生。WD的临床症状有血便、发热、精神沉郁、脱水、厌食和产奶量下降等，严重时，会导致贫血。该病毒可在粪便和鼻腔分泌物中检测到BCoV，一般潜伏期为2 d～8 d，发病率高达100%，但病死率很低。对患病动物支持性治疗效果良好，一般在2 d～3 d内恢复健康，发病通常会在1周～2周内结束。WD造成的经济影响巨大，特别是对奶牛产后影响最大，研究表明，与感染前的日产奶量相比，每次暴发的产奶量下降幅度可能在1%～70%之间。Toftaker I等[15]通过模拟线性混合模型来评估WD对奶牛产奶量的影响，并利用线性回归的方式来评估WD对牛奶成分的影响。发现在发病后2 d产奶量损失为15%，发病后的7 d～ 19 d平均每头牛损失量约为51 L。牛群产奶量在疫情发生4个月后仍有所下降。对牛奶成分的研究发现，牛奶中游离脂肪酸增加约11%，脂肪/蛋白质比小幅增加，WD可能使奶牛进入负能量平衡。Ribeiro J等[26]发现巴西牧场患有WD的牛同时还伴有呼吸道症状。

4.3 牛呼吸道冠状病毒

1982年，英国的Thomas L H等[27]在研究犊牛肺炎微生物时首次发现BCoV是一种呼吸道病原体。试验发现肠道分离的BCoV血清免疫凝集了呼吸道型BCoV，证明肠道型BCoV和呼吸道型BCoV是属于同一种血清型。呼吸道BCoV可感染不同年龄段的牛，临床表现为流鼻涕、呼吸困难、咳嗽和发热等，并伴有间质性肺炎和Ⅱ型肺细胞增生[11]。BCoV在牛呼吸系统疾病复合物(Bovine respiratory disease complex,BRDC)中的作用一直存在争议。在没有其他重要呼吸道病原体的情况下，自然发生BRDC的牛中可观察到BCoV的脱落，并且已经从肺中分离到BCoV。而多项研究结果表明，与较低BCoV抗体滴度牛相比，较高的BCoV抗体滴度牛在进入饲养场时更不容易发生BRDC。Workman A M等[28]的研究结果表明血清抗BCoV抗体滴度与病毒脱落无关，而病毒脱落与BRDC的发生呈正相关。

5 疾病临床诊断

BCoV常与其他病毒、细菌和寄生虫呈混合感染，如牛病毒性腹泻病毒、轮状病毒、大肠埃希氏菌、沙门氏菌和隐孢子虫等。临床诊断较困难，根据动物的疾病史、流行情况、临床表现和病理变化，只能初步诊断为BCoV感染[29]。若想进一步确诊，则需通过电子显微镜、病毒培养、血清学或分子检测等实验室手段进行确诊。

快速横向流动免疫分析技术可应用于奶牛和犊牛[30]，活体动物可采集鼻拭子和粪便样本，必须注意的是，BCoV在最初感染时病毒脱落率很高，随后停止脱落或变为间歇性脱落；病死动物可采集气管、鼻甲、结肠和肠系膜淋巴结等部位进行检测[24]。电子显微镜因灵敏度低而未被广泛使用。从肠道或呼吸道分离到的BCoV，可使用HRT-18细胞进行培养，但是这个操作较为繁琐，且耗时较长，不适用于临床诊断。免疫荧光或免疫组化染色用于检测组织中的病毒抗原。为了判定动物的血清学反应，可进行病毒中和试验、血凝抑制试验(hemagglutination inhibition,HI)和酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。使用ELISA可以检测鼻拭子和粪便样本中的抗原，由于牛的血清转化很常见，所以要做重复试验。分子检测方法耗时短、灵敏度高，被广泛应用，包括RT-PCR、套式RT-PCR、荧光定量RT-PCR和基因组测序[31]。BCoV N基因常被用作首选基因，因为N基因序列有较高的保守性。S基因则常被用于流行病学调查和病毒分离鉴定[32]。但是由于分子检测方法存在较高的灵敏度，也可能会导致假阳性结果。例如Oma V S等[18]对牛进行接种试验，接种第3周，没有犊牛被感染，接种第5周后，用RT-qPCR检测到病毒脱落，但是没有分离出病毒。

6 治疗

由于目前对病毒性疾病没有有效的治疗方法，一般常用支持性治疗。犊牛腹泻的治疗包括补充体液、葡萄糖和电解质等，以对抗脱水、低血糖、电解质失衡和酸中毒等病症。同时将犊牛置于温暖和干燥的畜栏中饲养。冬季痢疾通常是一种自限性疾病，然而，在晚期的病例中需要口服或静脉输液治疗，严重的痢疾则须输血治疗，也可配合使用非甾体抗炎药和抗出血药物[29]。对于呼吸道BCoV，由于继发性细菌感染很常见，仍建议抗菌治疗，配合使用非甾体抗炎药效果更好。

7 预防

BCoV是牛常见的感染性病原诱发因素，在宿主、病原体和环境相关的复杂因素之间发展。治疗BCoV诱发疾病的有效方法是使用抗菌药物和抗病毒药物，但过量使用抗菌药物会使牛产生耐药性，在机体残留，危害人类健康。只有提前预防BCoV的感染，才能有效减少抗菌药物的使用，进而提高动物产品质量。BCoV的预防最有效的方法就是疫苗接种，目前已有预防犊牛腹泻和冬季痢疾的疫苗。研究人员为妊娠母牛开发了一种灭活病毒疫苗，以通过初乳增强犊牛的被动免疫，预防犊牛腹泻。另一种是改良的犊牛口服活疫苗，也可预防犊牛腹泻。冬季痢疾可以使用富含血凝素抗原的灭活疫苗来预防。BCoV还经常与其他病原体混合感染，可导致呼吸道疾病，如犊牛肺炎和牛败血症。预防牛呼吸道冠状病毒可使用鼻内注射多价灭活疫苗或减毒活疫苗[33]。但是现在使用的商业疫苗中冠状病毒的基因型与牛流行毒株的基因型之间有差异，这种差异可能使疫苗对流行毒株没有保护作用[34]。为了提供最佳的免疫力，疫苗的抗原应尽可能与流行毒株相近。因此，未来的研究方向应侧重于流行病学监测，从而避免疫苗接种失败的可能性。

良好的饲养管理、干净的牛舍环境和生物安全都对预防BCoV起着至关重要的作用。BCoV对温度和消毒剂敏感，如次氯酸钠、700 mL/L乙醇和甲醛等。冠状病毒在低温和相对高湿度下存活良好，可在地面存活120 h，在有机介质中存活时间更长[35]。因此，应加强饲养管理，定期对牛舍进行打扫、消毒、通风并保持干燥的牛舍环境。挪威是世界上唯一实施BCoV控制规划的国家。自2016年以来，对BCoV进行血清学监测并对阳性和阴性畜群进行分类管理。该计划旨在通过采取生物安全措施保护畜群免受BCoV感染，从而预防疾病的发生。该生物安全措施包括对牛奶、初乳和犊牛及时进行血清学监测，将阴性动物设1年有效期，并鼓励农户购买BCoV阴性的犊牛；使用不同的运输工具对阳性和阴性的动物分开运输；对农场的管理人员等提供防护服和防护鞋；运输司机在不进入牛舍的情况下接触动物；最后，设立热线，及时报告疾病暴发，以限制疾病进一步的传播。