脂肪间充质干细胞治疗新型冠状病毒肺炎的研究进展

谭丽 综述 陈世玖 审校

遵义医科大学第五附属(珠海)医院，广东 珠海 519100

在过去的二十年里，严重急性呼吸道感染的高发病率被认为是主要的国际卫生问题之一。据估计，严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)和中东呼吸综合征(middle east respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)感染人数分别超过8 422人和1 600人，并导致超过916人和574人死亡[1]。2019年至今一种新型呼吸道传染疾病在全球范围内广泛流行，并被世界卫生组将该传染病毒命名为2019-新型冠状病毒(COVID-19)，其发病率和死亡率相比SARS-CoV和MERS-CoV更高。截至2021年8月27日，世界卫生组织累计报告全球确诊病例达2亿余人，累计死亡病例达400万余人。目前除了需要广泛接种疫苗，还需要开发安全有效的治疗方式。

医疗卫生行业正在研究可行的方法来遏制这场全球威胁，包括使用维生素、抗病毒药物和恢复期血清抗体，以及开发疫苗。许多治疗方案都仍在被研究，近几个月来，人们对在新冠肺炎患者中使用间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)疗法越来越感兴趣。因其具有抑制炎症和分泌细胞因子的功能，正如几个实验中证明[2-3]：MSCs治疗急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)模型的早期研究报告显示，MSCs具有改善肺部微环境、抑制过度活跃的免疫系统、促进组织修复、保护肺泡上皮细胞、预防肺纤维化和保存长期肺功能等作用。脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)是表达这些重要特征的一种MSCs类型，被认为是治疗COVID-19相对安全的工具，能够降低其重症率和死亡率。

1 COVID-19的发病机制

1.1 SARS-CoV-2感染 COVID-19的常见临床特征包括发热、头痛、咳嗽、骨痛、肌痛、嗅觉障碍、味觉减退和呼吸困难。SARS-CoV-2感染的发病机制包括病毒刺突蛋白识别血管紧张素转换酶-2(angiotensin converting enzyme-2，ACE-2)和细胞跨膜蛋白酶丝氨酸-2(transmembrane protease，serine-2，TMPRSS-2)启动刺突蛋白促进宿主细胞进入和扩散[4]。严重的呼吸系统疾患是SARS-CoV-2感染的主要后果，因为ACE-2受体广泛表达于肺泡Ⅱ型细胞和毛细血管内皮细胞。此外，肺泡细胞表达TMPRSS-2，病毒性肺部感染导致炎症因子的产生，大量炎症因子快速外流。在17.3%的患者中，炎症因子水平的升高导致广泛的肺组织水肿、肺弥散功能障碍、急性呼吸困难，继发感染和死亡[5]。由于细胞因子级联反应快速的进展，导致危重的新冠肺炎患者常发展成为ARDS。

1.2 难以逆转的肺损伤-ARDS ARDS是以低氧血症、肺水肿、弥漫性肺泡损伤和多器官衰竭为特征的多因素严重肺部损伤，其是由严重的肺部和全身炎症引起的，中性粒细胞和巨噬细胞侵入肺泡腔，白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎症因子的局部释放导致肺内皮细胞和上皮细胞损伤，在这种炎症反应下肺内活性氧产生增加，损害肺屏障功能，血管通透性增加，促进肺泡蛋白渗出物积聚，最终导致肺纤维化[6]。目前管理和治疗ARDS仍提倡内源性修复，减少呼吸机引起的肺损伤，以帮助肺损伤恢复。有证据表明，神经肌肉阻滞和俯卧位可以提高ARDS患者的存活率，同时机械通气和限流管理可提供器官氧气支持，将医源性伤害降至最低[7]；此外还几种药理学方法，包括使用糖皮质激素、表面活性剂、吸入一氧化氮、抗氧化剂和蛋白酶抑制剂等，但这类治疗效果都欠佳。目前，还没有针对ARDS的直接治疗方法。

2 ADSCs

2.1 ADSCs的优越性 1968年，FRIEDENSTEIN等[8]科学家从骨髓中分离出骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells from bone marrow，BM-MSCs)，然后将其命名为集落成纤维细胞(colony-forming unit fibroblast，CFU-F)。1991年，CAPLAN将这些细胞命名为间充质干细胞(MSCs)，因为它们在胚胎发育过程中起源于间充质，并具有分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的能力[9]。然而，骨髓来源的MSCs并不适合临床应用，因为其需要进行高侵入性的抽吸程序，并且随着年龄的增加，增殖和分化能力都会下降。21世纪初在寻找替代骨髓干细胞来源的过程中，ZUK等[10]发现了一种从形态和表型上与MSCs相似的，从脂肪组织中分离出来的多潜能、未分化并自我更新的祖细胞群体。通过微创的方法提取皮下脂肪组织，并经过简单的分离程序可以得到ADSCs；其次，干细胞的质量和增殖能力不会随着患者年龄的增长而下降，与骨髓来源的MSCs相比具有明显的优势。实验临床研究都证实了其具有显著的抗炎作用[11]；并且经培养扩增的MSCs表达低水平的MHCⅠ类分子，不表达MHCⅡ类分子或分子B7-1、B7-2或CD40；与BM-MSCs相比，ADSCs表达的HLA-Ⅰ类分子水平甚至更低[12]。因此MSCs在同种异体移植后不会引发典型的免疫反应，这使得在临床治疗中使用来自其他捐赠者的MSCs成为可能[13]。

2.2 ADSCs的应用 ADSCs具有三胚系分化潜能，因而具备抗凋亡、抗炎、促血管生成、免疫调节和抗瘢痕的作用[14]，为其在再生医学中广泛的治疗应用提供了良好前提条件。到目前为止，临床应用也较为广泛，例如软组织再生、骨骼组织修复、缺血性损伤、心肌梗死和免疫紊乱(包括狼疮、关节炎、克罗恩病、多发性硬化症、糖尿病和移植物抗宿主病)。鉴于ADSCs具有巨大的治疗潜力，故在整形与重建外科中广泛应用，如面部创面修复及切除后的乳腺重建；由于ADSCs具有分泌细胞因子、趋化因子和生长因子的特性有助于有效的抗瘢痕治疗[15]，对于细胞外基质的聚集和重塑或炎症发生引起的增生性瘢痕能起有效治疗作用。此外，它们能够分化成不同的细胞系，并分泌高水平的蛋白质，这些蛋白质在免疫调节、血管生成、血管重建、皮肤伤口愈合和组织再生方面发挥功能。除了分泌功能性蛋白质外，还可以释放胞外体，被定义为具有多囊泡的细胞外小泡(extracellular vesicles，EVs)[16]。研究表明干细胞来源的胞外体通过旁分泌或内分泌信号将蛋白质、mRNAs、microRNAs(MiRNAs)和DNA分子从一个细胞转移到另一个细胞[17]，它是调节细胞生物学行为、细胞间信号传递的工具，如血管生成、免疫调节、增殖和迁移等[18]。ADSC-EVs的疗效和治疗益处已经在广泛的疾病中得到了观察和证实，并对未来治疗应用的发展非常重要，例如皮肤修复、再生工程和肿瘤应用等。

3 ADSCs治疗COVID-19的潜能

3.1 注入的MSCs在肺中聚集 静脉输注的MSCs会在肺部积聚，分泌大量旁分泌因子，在保护或恢复肺泡上皮细胞、对抗肺纤维化和改善肺功能方面发挥重要作用。静脉注射后，MSCs具有定位能力和作用于其他受损的器官，如心脏、肝脏和肾脏[19]。此外，小部分MSCs进行了移植。在靶器官中，当它们在肺的微血管系统中时[20]，会对肺脏起良好治疗效果。

3.2 治疗机制 MSCs具有以下作用：免疫调节、抗病毒、促使抗炎分子产生、抗菌及能促进巨噬细胞清除细菌、抑制肺纤维化和瘢痕形成、分泌促有丝分裂和抗凋亡的分子、清除肺内的肺泡液、产生细胞外小泡。

3.2.1 免疫调节 研究表明，新冠肺炎患者的调节性T细胞数量会减少，特别是病情重的患者[21]。ADSCs能增加调节性T细胞(Treg)的生成，并且比BM-MSCs能更有效地促进Treg细胞的发育[22]。MSCs表现出对CD19+B细胞、CD4+Th1细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞的增殖、激活和成熟的抑制作用，ADSCs对树突状细胞分化的免疫调节已被证明比BM-MSCs更有效[23]。当骨髓间充质干细胞被免疫细胞吞噬时，会引起单核细胞表型和功能的改变，进而调节免疫系统细胞[24]。

3.2.2 抗病毒 MSCs抑制病毒的复制、脱落并减少病毒诱导的肺上皮细胞(lung epithelial cell，LECs)损伤。KHATRI等[25]证明了MSCs来源的胞外囊泡(MSC-EVs)通过将RNA从EVS转移到LECs来促进抗炎和抗病毒特性，在猪流感病毒性肺炎模型中证明气管内注射MSC-EVs可以显著减少病毒进入LECs及病毒复制。

3.2.3 促使抗炎因子产生 在许多急性肺损伤模型中，间充质干细胞的应用已显示出其具有的抗炎作用[26]。间充质干细胞将炎症中释放大量的促炎细胞因子(包括IL-1β、IL-6、MCP-1、MIP-2、CXCL-1、CXCL-2、TNF-β、IL-12和IL-17等蛋白酶)转变为抗炎状态；释放大量抗炎细胞因子包括IL-4、IL-10、转化生长因子-α、CCL18、前列腺素E2、IDO、一氧化氮，这种转变促进了炎症消退和组织修复。

3.2.4 抗菌 间充质干细胞具有天然的抗菌特性，这一特性已在体外和动物实验中得到证实。间充质干细胞对细菌直接清除是由LL-37通过Toll样受体-4信号通路和Lipocalin-2通过β-防御素-2介导的[27-28]。研究表明，当巨噬细胞从促炎表型重新编程为抗炎表型时，MSCs可以增加其的吞噬活性[29]。

3.2.5 抑制肺纤维化 有关动物模型证明，早期应用MSCs来改善炎症和中度纤维化肺组织重塑是有效果的[30]。此外，MSCs分泌的细胞生长因子(keratinocyte growth factor，KGF)参与了肺上皮修复。研究表明，经修饰表达KGF的BM-MSCs在小鼠模型中被证明对博莱霉素诱导的肺纤维化治疗有效[31]。

3.2.6 分泌促有丝分裂和抗凋亡的因子 MSCs通过分泌血管内皮生长因子、胰岛素生长因子、肝细胞生长因子、神经营养因子-3和神经生长因子等生物活性因子，通过线粒体及微泡转移发挥抗凋亡作用[32]。肺损伤也可以通过自噬得到改善，这可能是由于MSCs作用于抗氧化应激、细胞保护和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(P13K/Akt)信号通路引起的[33]。

3.2.7 清除肺泡液 肺泡Ⅱ型细胞约占肺泡表面积的2%～5%，它们产生表面活性剂并作为肺泡上皮的祖细胞。肺泡液是由钠离子和氯离子通过上皮细胞膜上的转运体沿渗透梯度移动，以离开肺泡并维持中空结构。ARDS患者的肺泡清除力(alveolar fluid clearance，AFC)受损，是导致ARDS发病率和死亡率较高的原因[34]。多项研究证实，MSCs与钠离子和氯离子通道的相互作用增强了AFC，并促进了肺水肿得到缓解[35]。LOY等[36]的研究结果显示：在甲型H5N1流感病毒相关的急性肺损伤中，MSCs改善了AFC和肺泡通透性(alveolar protein permeability，APP)，并且研究发现联合应用肝细胞生长因子和血管生成素-1可以恢复AFC和APP，但联合应用效果不如单独使用MSCs。

3.2.8 胞外体 目前，研究表明MSCs产生EVs有助于减轻急性肺损伤[37]。来源于BM-MSCs的EVs接种于细菌性肺炎的小鼠，可减少炎症细胞、炎症因子、炎症介质和细菌的流入。EVs的摄取对于疗效至关重要，在体外灌流的细菌性肺炎模型上测试了EVs的治疗效果，从人BM-MSCs条件培养液中分离EVs，给予EVs可显著增加肺泡液清除率，降低蛋白通透性，并降低损伤肺泡内的细菌含量。此外，经EVs治疗后，分离的人肺泡巨噬细胞的抗菌活性增强[38]。

4 MSCs治疗ARDs的实验研究

在大肠杆菌内毒素、缺氧和呼吸机诱导的肺损伤动物模型中，MSCs促进肺损伤动物模型的恢复[39]。在这些模型中，MSCs抑制肿瘤坏死因子-α的释放，促进IL-10的分泌，降低IL-6水平，增加KGF和血管生成素-2的表达，促进巨噬细胞功能的重新编程和抗菌肽的分泌[39]。MCINTYRE等[40]对17项关于临床前动物模型的死亡率进行了回顾性研究发现：与对照组相比，MSCs治疗显著降低了急性肺损伤动物的总体死亡率。在一项常发疾病研究中，ADSCs被用来治疗肺泡上皮和肺泡的病变[41]，ADSCs被认为可以修复肺部病患处受损的血管，防止肺毛细血管出血，降低肺动脉高压，减轻血管周围炎症和纤维化。

此外，MSCs具有抗菌和抗炎作用。在不同的ARDS模型中，全身和气管内注射MSCs靶向作用于肺损伤最明显处，减轻肺部和全身炎症，提高细菌清除率，并增加AFC和气体交换能力，从而降低ARDS的死亡率[42]。

已有相关临床研究证明MSCs治疗ARDS的有效性。SIMONSON等[43]对2例严重难治性ARDS患者静脉注射异基因BM-MSCs 2×106个/kg治疗，两例患者均从多器官衰竭中恢复，其肺泡灌洗液和血浆中的上皮细胞的凋亡程度，肺泡毛细血管液体的渗出量，促炎因子、miRNAs和趋化因子的标志物均降低。MATTHAY等[44]报道了一项前瞻性、双盲、多中心、随机试验的研究，以评估BM-MSCs治疗ARDS的疗效，在40例中重度ARDS患者中单次静脉注射BM-MSCs 10×106个/kg与安慰剂进行比较，BM-MSCs组血浆中血管生成素-2水平的下降幅度明显大于安慰剂组。有关实验证实血管生成素-2浓度的降低与抗炎介质的释放有关，从而减轻肺损伤[45]。BM-MSCs治疗组患者的疾病严重程度评分高于安慰剂组，但各组之间的死亡率没有显著差异，故通过BM-MSCs治疗。单次静脉注射BM-MSCs对中、重度急性呼吸窘迫综合征患者是安全的，仍需进行更大规模的试验来评估疗效。

5 MSCs治疗COVID-19的临床研究

MSCs通过释放各种旁分泌因子和外泌体，调节免疫系统，防止细胞因子释放综合征，并促进内源性肺损伤修复，可对COVID-19起治疗作用，针对COVID-19的细胞治疗临床研究正在增多[46]。

LIU等[47]回顾性分析了109例患有及不患有ARDS的新冠肺炎患者之间的差异，患者的平均年龄为55岁，平均随访时间为15 d，总存活率为71.6%。在所有患者中48.6%的患者发生了ARDS，与非ARDS患者比较，ARDS患者年龄较大，并合并有其他疾病。总之，尽管使用了抗病毒、糖皮质激素或免疫球蛋白治疗，ARDS患者存活率仍无明显改善。

LIANG等[48]报道了一例感染SARSCoV-2的重症65岁女性的治疗。2020年1月27日，患者先出现疲劳、发烧和咳嗽，接着第二天出现胸闷，缺氧和高血压，并检测出2019年新型冠状病毒阳性。最初采用抗病毒、干扰素-γ雾化吸入、奥司他韦、静脉注射莫西沙星、血必净、甲基强的松龙和免疫球蛋白、由机械呼吸机维持等治疗。几天后被诊断出患有危重型新冠肺炎并伴有急性呼吸衰竭，被转移到重症监护病房接受呼吸机支持，并停用糖皮质激素和抗病毒治疗，1周后静脉注射50×106个同种异体UC-MSCs，未发现明显的不良反应。在首次治疗后第3天和第6天重复治疗。输注第三剂疫苗2 d后，后转出重症监护病房，生命体征和实验室指标正常，咽拭子新冠肺炎抗原检测呈阴性。这项研究仅限于一例危重患者，但积极的治疗效果支持更深一步的研究。

LENG等[4]报道了静脉注射UC-MSCs对7例新冠肺炎患者有改善功能和促进康复的作用。入选病例均为SARS-CoV-2阳性，其中1例为危重症，4例为重型，2例症状较轻；另有3例重症患者参加了安慰剂对照。输注MSCs前所有患者均出现高热、呼吸急促、低血氧饱和度和肺炎等临床表现。当症状加重时，患者静脉注射1×106个UC-MSCs/kg，并密切随访14 d，症状在注射MSCs后的2～4 d内消退，胸部CT显示肺炎浸润程度明显消退，并且没有不良反应。大多数患者在输注MSCs后一周或两周后的SARS-CoV-2核酸检测呈阴性，MSCs可以显著改善这7例患者的肺功能，并且没有观察到任何不良反应。虽然短期没有观察到不良反应，但在未来的临床研究中仍有必要对MSCs应用后长期随访。

6 ADSCs安全性存在的争议

虽然ADSCs在再生医学领域具有广大的应用前景，但是其能促进残留肿瘤细胞增殖、分化或转移，甚至诱导新的癌变，这一点是不可忽视的。因此，ADSCs在临床应用是否安全的问题在当前广泛讨论。有研究发现，对于乳腺癌，癌细胞刺激间充质干细胞重新分泌趋化因子CCL5以旁分泌的方式作用于癌细胞，因此增强癌细胞的运动性、侵袭性和转移性[49]。此外，还有研究报道了ADSCs与人鳞状细胞癌细胞的相互作用：在与ADSCs共培养时，鳞状细胞癌细胞的侵袭行为显著增加，使得肿瘤风险加大[50]。但目前在临床应用中还未出现上诉副作用，在121例乳腺癌患者中仅有一例在细胞辅助脂肪移植后发现癌症复发，低于该人群的预期复发率[51]。在一项针对8例脊髓损伤男性的临床试验中，在一次静脉注射4亿个自体ADSCs后没有发现肿瘤发展的证据[52]。现ADSCs治疗恶性肿瘤仍存在争议，针对COVID-19合并恶性肿瘤患者的ADSCs治疗还需进一步研究。

7 展望

新冠肺炎疫情形势仍较为严峻，最早在印度被发现的新冠病毒变异毒株德尔塔毒株已传播到了74个国家，而且还在快速传播。这一毒株不但传染性强，感染者更易发展成重症。面对重症患者数量的激增，改善症状和多器官损伤修复尤为重要。ADSCs被认为是应用于再生治疗的理想细胞，在于以微创的简易的方式获得，并且具有沿着中胚层、外胚层和内胚层谱系分化为成熟细胞的高潜力[53]。静脉注射ADSCs可以有效地对全身多个器官的损伤进行修复，但在常规临床应用之前，还有一些问题需要解决。完全了解调控它的潜在机制，例如，在未来的实验对ADSCs更精准的标记，以便能够实现靶向治疗；此外还需更多的实验研究其潜在的危险风险性。