乙酰肝素酶在涎腺腺样囊性癌中的研究进展

龙琴 综述 吴发印，夏鹏 审校

遵义医科大学第五附属(珠海)医院口腔颌面外科，广东 珠海 519100

腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma，ACC)是来源于外分泌腺的恶性肿瘤，约占涎腺恶性肿瘤的22%，是涎腺第二大恶性肿瘤，易沿周围神经和血管侵袭，局部复发率高，可通过血性转移导致肺部等远处转移[1-2]。治疗方法早期以手术切除后辅助局部放疗为主。因其特殊的生物学行为，晚期转移性头颈ACC的治疗目前尚无明确的治疗方案，化疗仍是一线治疗手段，但其治疗价值仍存在争论[3-5]。细胞外基质(extracellular matrix，ECM)和 基 底 膜(basement membrane，BM)是肿瘤细胞侵袭及转移的重要屏障。硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans，HSPG)存在于细胞表面和细胞外基质中，是一类由核心蛋白和(乙酰)硫酸肝素(heparan sulfate，HS)多糖链组成的蛋白多糖的总称，通过影响肿瘤细胞增殖、黏附、侵袭和血管生成的信号通路，在癌症的发生和发展中发挥重要作用[6]。乙酰肝素酶(heparanase，HPSE，HPA)是新近发现并克隆出来的一种内切糖苷酶，可降解糖氨聚糖中的HS侧链，在肿瘤细胞的侵袭和转移方面具有重要作用。而关于HPSE在ACC中的表达、侵袭及转移的关系国内外报道较少。本文就鲜有文献对HPSE在ACC中的研究进展做一综述。

1 HPSE的基因定位及蛋白质结构

1975年HÖÖK及其同事在鼠肝脏组织中首次发现HPSE是一种降解HS侧链的内切糖苷酶[7]。直至1997年VLODAVSKY等[8]从人肝癌及胎盘中分离纯化50 kDa HPSE，并报道克隆了编码这种酶的cDNA和基因。人类HPSE有两种亚型HPSE1和HPSE2，其中HPSE1是目前肿瘤研究的主要内容，HPSE-2与HPSE-1具有约40%的相似性，但发挥的活性却不同[9]。在人类中，乙酰肝素酶由单拷贝HPSE基因编码，该基因位于染色体4q21.3[10]上并通过选择性剪接表达为两种mRNA种类，分别是5 kb和1.7 kb[11]。后续学者们对HPSE进行了更为详细的研究。HPSE是一种内切-β-葡萄糖醛酸酶，属于糖苷水解家族79，来自糖苷水解家族A。该酶通过水解葡萄糖醛酸(GlcUA，G)和α-D-葡糖胺(GlcN，N)残基之间的β-1,4-糖苷键来降解HS。所有HPSE的三维结构一直难以捉摸，但二级结构预测和建模表明(α/β)8 TIM桶折叠，桶的一侧有一个活性位点裂缝[12]，以及两个假定的关键人类HPSE的定位活性位点残基：Glu225和Glu343，位于活性位点裂隙内[13]。最近，VINADER等[14]建立了一种新的人肝素酶同源性模型，并提出了底物与酶的结合模式和关键结合元素，以及参与催化的必需活性位点氨基酸残基。HPSE在几乎所有人类肿瘤中都过表达，并且在其过表达与肿瘤细胞的转移潜力之间观察到相关性。因此，HPSE被认为对肿瘤细胞的侵袭和转移具有重要意义，也使其成为抗癌药物发现的理想靶点。

2 HPSE与肿瘤的关系

2.1 HPSE与肿瘤侵袭与转移 肿瘤的侵袭及转移是一个多基因、多因素、多步骤的综合过程。包括癌细胞从原发灶脱离，侵袭周围组织，进入循环系统，逃避免疫监视，形成肿瘤血管，在远处器官形成转移灶。在转移过程中的一个关键而必需的步骤就是肿瘤细胞穿越ECM和BM形成的天然屏障，侵袭周围组织及血管。ECM作为一种细胞分泌组装的蛋白质和多糖的复杂网络结构，不仅能为细胞提供附着位点和结构支持，还可以为调节细胞活性和器官、组织功能提供重要的生物信息[15]。HPSE通过切断ECM细胞表面的HS侧链，使附着在SDC1上的相关生物活性分子被释放出来，形成HPSE/SDC1轴，驱动生长因子信号传导和调节细胞行为，并重塑ECM，促进了恶性肿瘤的生长、转移和血管生成[16]。在很多肿瘤组织中，HPSE的mRNA和蛋白均呈高表达，而在肿瘤周围正常组织中检测不到。HPSE存在的细胞更易于被转移性肿瘤和免疫细胞入侵[17]。而沉默HPSE基因可抑制肿瘤细胞的增殖和转移，其机制可能与HPSE蛋白或基因可促进肿瘤细胞的增殖和转移有关。

2.2 HPSE与恶性肿瘤的关系 大量研究显示HPSE在胃癌[18]、结肠癌[19]、胰腺癌[20]、膀胱癌[21]和宫颈癌[22]中高表达，并与肿瘤浸润、高淋巴转移、高远处转移、高微血管密度和预后差有关。幽门螺杆菌感染是胃恶性肿瘤最重要的危险因素，一些研究表明，幽门螺杆菌感染通过激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)导致胃腺癌的发生。一旦激活，MAPK就会转移到细胞核并导致转录因子的激活，如NF-κB。最近的一项研究也表明，MAPK途径的激活与HPSE的表达密切相关[23]。幽门螺杆菌感染胃癌激活MAPK信号，导致HPSE激活，HPSE的表达增高，其侵袭和转移能力增加[24]。HAO等[25]研究发现肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)和HPSE的高表达与TNM分期、浸润深度和预后不良呈正相关。在MKN74细胞中，外源性HGF显著增加了HPSE在mRNA和蛋白质水平的表达。进一步的研究表明HGF首先激活PI3K/Akt信号，NF-κB信号在PI3K/Akt下游被激活，并促进HPSE的表达。然而，当使用c-met、PI3K/Akt或NF-κB信号抑制剂时，HPSE表达显著降低。这些结果表明HGF可通过PI3K/Akt和下游NF-κB信号调节HPSE的表达，从而促进HPSE表达和随后的肿瘤转移。CHEN等[20]观察到上调的FGF2通过激活PI3K/Akt信号通路来增加下游Palladin蛋白的表达，并导致上皮间质转化(EMT)的激活。随后发现EMT促进胰腺癌细胞的迁移和侵袭。HPSE/SDC1轴在FGF2的调节中发挥重要作用，并促进胰腺癌细胞的侵袭和转移，HPSE/SDC1轴可作为胰腺癌的有效治疗靶点。卢书芳等[26]研究发现宫颈癌组织中HPSE表达水平明显高于正常宫颈组织。HPSE可作为宫颈鳞癌淋巴结转移的生物学指标。HPSE的表达与宫颈癌的临床分期、淋巴结转移、脉管浸润和预后有关。并通过实验研究发现HPSE通过影响p53、c-Myc、h-TERT的表达，σ1R下调p53的表达，Rad21作为Wnt/β-catenin通路的守门人，调控细胞周期和XPO1的核输出功能，Wnt/β-catenin信号通路阻滞剂XAV939通过下调tankyrase、β-catenin及Rad21蛋白的表达，参与宫颈癌的发病机制，增加对铂类化疗药物的敏感性。

2.3 乙酰肝素酶与血管生成 HPSE具有两种活性、酶活性和非酶活性，这两种功能都会影响ECM和BM结构完整性。HPSE二聚体的酶活性由50 kDa和8 kDa非共价连接的亚单位组成，导致ECM重塑，从而导致细胞因子、生长因子和脂蛋白的扩散，增强血管生成、免疫系统激活、凝血、自噬加速等。HPSE的非酶活性与高凝状态有关，HPSE是组织因子的辅助因子，组织因子通过凝血酶和纤维蛋白升高，最终激活血小板，导致肿瘤内血栓形成[27]。研究表明乙酰肝素酶的上调与肿瘤患者血管密度增加和术后生存期缩短有关[28]。HPSE增强Akt信号，刺激PI3K和p38依赖内皮细胞迁移和入侵。它还通过Src路径促进VEGF表达。因此，这种酶可以激活内皮细胞，并引起血管生成和生存反应。对HPSE过度表达转基因小鼠的研究表明，这种酶在正常过程中具有细胞动员、HS周转、组织血管化和改造等功能[29]。HPSE密切参与血管生成，既直接通过促进内皮细胞的侵入(血管萌芽)，也间接通过释放HS结合碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，产生促进bFGF活性的HS降解片段。通过基质胶塞试验已证明体内乙酰肝素酶的血管生成潜力，Eb T淋巴瘤细胞在用HPSE基因转染后诱导的新血管形成增加了3～4倍。HPSE促进肿瘤血管生成和转移的能力使其成为癌症治疗的有希望的靶点[8]。

3 HPSE与ACC

ACC是颌面部涎腺常见的恶性肿瘤，因其侵袭性强、转移率高的特点，该肿瘤治疗及预后不佳。BEN-IZHAK等[30]报道了HPA基因及其表达产物与涎腺恶性肿瘤的发生、侵袭、转移以及预后的相关性，结果显示：70%的涎腺恶性肿瘤患者HPA基因表达为阳性，HPA基因的表达水平与涎腺恶性肿瘤细胞的侵袭和转移能力呈正相关，HPA基因表达为阳性的患者其生存率显著低于HPA基因表达为阴性的患者。吴祥冰等[31]发现HPA在涎腺恶性肿瘤中的阳性表达率为61.4%，显著高于其在涎腺良性肿瘤中的阳性表达率(21.4%)，彼此之间有显著差异。说明HPA在涎腺肿瘤中的表达与肿瘤的病理类型无关，而与肿瘤的良恶性质相关。王新等[32]采用免疫组织化学的方法研究发现涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)中HPSE的表达高于正常涎腺组织，且HPSE在SACC组织中的表达与患者年龄、原发肿瘤大小及肿瘤原发部位无关，与肿瘤组织分型、神经侵袭及远处转移有关，提示HPSE蛋白的高表达可能促进SACC的神经侵袭及远处转移。同时王新团队[33]利用RNA干扰技术沉默人SACC-M细胞中的HPSE的mRNA和蛋白表达，可抑制SACC-M细胞的侵袭和迁移能力。因此推测HPSE在SACC的恶性进展中可能起着相当重要的作用，可能会成为预防和治疗ACC侵袭、转移的新靶点。骆树瑜[34]采用免疫组化方法检测42例ACC组织及癌旁组织和5例正常涎腺发现，HPSE在临床分期为Ⅲ、Ⅳ期ACC患者中的表达明显高于Ⅰ、Ⅱ期ACC的患者；同时在神经侵袭组的表达高于非神经侵袭组，提示HPA可促进SACC的侵袭转移，设法干预HPA的表达，可能阻断SACC的嗜神经侵袭。王尚凯等[35]发现HPA与S-100在腺样囊性癌蛋白上的表达是一致的，与肿瘤嗜神经侵袭性、局部侵袭性和远处转移相关，与患者的年龄、性别和临床分期无关。这与王新团队[33]研究的结果是一致的。HPSE与SACC的生长和浸润转移密切相关，可作为一项检测指标，用于SACC的联合诊断、病情评估、疗效观察和预后预测。HPSE抑制剂及乙酰肝素酶反义寡核苷酸的研究将为SACC的诊治提供理论依据。

4 HPSE抑制剂研究进展

大量实验及研究证实了HPSE在肿瘤侵袭转移和血管生成发挥重要作用，学者们纷纷把眼光投入对HPSE抑制剂的研究中。HPSE抑制剂包括：肝素类似物、硫酸寡聚糖及寡聚糖类似物、中和抗体、天然药物等。其中寡聚糖类似物、硫酸乙酰肝素模拟物PI-88成为研究热点。硫酸乙酰肝素模拟物PI-88是硫酸化寡糖的复杂混合物，在20世纪90年代后期被鉴定为HPSE的有效抑制剂。在临床前动物模型中，它被证明可以阻断血管生成、转移和肿瘤生长，并随后成为第一个进入癌症临床试验的HPSE抑制剂[36]。PI-88是一种单磷酸化、多硫酸化甘露糖低聚糖的复杂混合物，由来自Pichia holstii NRRL Y-2448磷酸甘露糖的低聚糖磷酸部分(OPF)磺化制备而成。它本质上是一种底物模拟物，通过静电相互作用与酶的活性位点结合，并阻断HS底物的访问[37]。PI-88还阻断血管生成生长因子(如FGF-1、FGF-2和VEGF)与HS及其受体的相互作用，并刺激内源性抗血管生成蛋白、组织因子途径抑制剂的释放[38]。HOSSAIN等[39]通过研究发现，PI-88有效的阻断了HS的两个硫酸化位点的活性。PI-88是第一个在癌症患者的人类临床试验中进行评估的乙酰肝素酶抑制剂，最终进展到肝癌切除后的Ⅲ期试验。尽管有早期的承诺，但它未能达到其主要终点，并且尚未批准使用。然而，其早期临床和临床前的成功激发了对下一代HS模拟乙酰肝素酶抑制剂的研究，该抑制剂具有更好的性质和更大的效力。这些努力导致了PG545(匹克西莫德)的发现和选择，用于临床开发[40]。PG545不仅是一种有效的乙酰肝素酶抑制剂，而且最近被证明具有免疫调节活性，这可能是其作用机制的关键组成部分。PG545最近完成了晚期实体瘤患者的Ⅰa期研究[41]。HS模拟乙酰肝素酶抑制剂在乙酰肝素酶介导的一系列其他适应证中显示出前景，有待进一步的开发及研究。

5 结语

目前已知HPSE除参与癌症外，还参与一系列病理学，包括炎症、糖尿病、骨坏死、肝纤维化、淀粉样变和阿尔兹海默症，以及多种病毒的感染和传播[11，42-44]。HPSE在SACC的增殖、侵袭转移和血管生成方面均有较大的临床指导意义。而目前对于HPSE在SACC的侵袭、转移及血管生成分子机制的研究十分有限，仍有很多问题需要进一步探索研究。随着分子生物学技术的发展及HPSE研究的逐步深入，HPSE有可能成为评估SACC预后或治疗反应的分子标志物，为SACC特定靶向诊断和治疗开辟新的途径，并为SACC的早期诊断及治疗提供新的思考方案。未来也仍需进一步开发乙酰肝素酶抑制剂并进行临床试验的研究，以明确乙酰肝素酶抑制剂的作用，从而更好地服务于临床。