免疫荧光技术在皮肤活检组织真菌染色中的应用

陈学超 于永翔 王建文 暴芳芳 周桂芝 陈声利 卢宪梅 刘永霞

山东第一医科大学附属皮肤病医院(山东省皮肤病医院)，山东省皮肤病性病防治研究所，济南，250022

真菌感染是皮肤科常见皮肤病之一，分为浅部真菌病和深部真菌病。真菌病原学检查是诊断真菌病的根本依据，真菌病原学检测手段一直以来也是临床最为迫切的需求。目前真菌检测方法主要包括直接镜检、真菌培养、血清学试验、组织病理学检查等。组织病理学检查方法主要有苏木素-伊红(HE)染色、过碘酸-雪夫氏液染色(Periodic acid-Schiff stain，PAS)、Gomori六胺银染色(Gomorig methenamine silver stain, GMS)等。

近年来又出现了真菌免疫荧光染色技术[1]，其荧光染料的主要成分是荧光增白剂(calcofluor white, CFW)，能与多种植物以及真菌细胞壁上的几丁质和纤维素亲和，在350～400 nm波长下发出亮蓝色荧光；因真菌细胞壁含有几丁质和纤维素的β葡聚糖成分，在荧光显微镜视野中能清晰观察真菌形态。我们对43例皮肤真菌感染其中深部真菌感染病例41例石蜡包埋切片进行免疫荧光染色，并与传统的PAS染色法进行比较，以期为病理技术中真菌的检测提供一种新的辅助方法。

1 对象与方法

1.1 研究对象 回顾研究山东第一医科大学附属皮肤病医院2019年1月至2020年12月临床确诊的43例皮肤真菌感染患者，其中男19例，女24例，平均年龄59.3岁；感染部位：面部10例，上肢13例，手14例，指甲1例，胸部2例，背部2例， 下肢1例。其中包括：孢子丝菌37例，着色真菌1例，花斑癣1例，马拉色菌1例，其他真菌感染3例。入选标准同时满足以下条件：(1)病理活检组织学上明确诊断感染性肉芽肿或浅部真菌病；(2)真菌镜检与培养证实为真菌感染。

1.2 检测试剂 荧光染色剂工作液(济南德亨医学科技有限公司)；PAS染色剂：自配(碱性品红：上海试剂三厂)。

1.3 实验方法 将入选的43例真菌病患者的石蜡包埋组织块2 μm连续切8片，每张载玻片捞片4张，脱蜡至水洗，分别进行免疫荧光染色和PAS染色。

PAS染色：滴加高碘酸室温孵育10分钟；蒸馏水洗，滴加shiff氏液，室温孵育20分钟，流水冲洗，苏木素衬染，脱水、透明、封片；光学显微镜下观察。

免疫荧光染色：在暗室内，将免疫荧光染色剂直接滴加在待检标本上，盖上盖玻片，立即放置于荧光显微镜下观察。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件，两种真菌检测法阳性率比较采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 镜下表现 PAS染色：需每个视野仔细查找，耗时长；镜下表皮基底膜呈红色线状或带状，真菌孢子呈圆形或椭圆形，孢子壁呈红色圆环状；真菌菌丝呈红色棒状或条状；背景为蓝紫色(图1)。

免疫荧光染色：低倍镜即可快速发现孢子或菌丝，耗时短；镜下真菌孢子呈圆形或椭圆形，呈亮蓝色或蓝绿色；真菌菌丝呈亮蓝色棒状或条状；背景呈暗蓝色(图1)。

1a:PAS染色示浅部真菌病角质层内见紫红色真菌菌丝、孢子(×200);1b、1c：免疫荧光染色角质层见较多亮蓝色菌丝、孢子(×200)；1d:PAS染色示真皮多核巨细胞内圆形孢子(蓝色箭头所示)(×400);1e、1f：免疫荧光染色真皮内见多个亮蓝色圆形孢子(红色箭头所示)(1e:×200;1f:×400)

2.2 PAS染色与免疫荧光染色两种方法比较 43例皮肤真菌病患者中PAS染色阳性27例(62.8%)，免疫荧光染色阳性30例(69.7%)。经卡方检验，PAS染色法阳性率与直接免疫荧光染色法阳性率比较：χ2=0.468240,P=0.493798，两者之间无统计学意义。

2.3 免疫荧光与PAS两种染色方法联合使用 43例皮肤真菌病患者PAS染色与免疫荧光染色两种方法均阳性19例(44.2%)，其中有一种方法阳性38例(88.4%)，两种方法均阴性5例(11.6%),见表1。

表1 免疫荧光染色法与PAS染色法结果比较 例(%)

3 讨论

真菌可以引起皮肤、黏膜、皮下组织及其它器官的感染，在感染性疾病中，真菌感染病原菌种类最多，发病率最高、流行也最广。皮肤是人体的一大器官，真菌感染常先表现在皮肤上，皮肤真菌感染分为浅部真菌病和深部真菌病。真菌的检出对临床的诊断和治疗显得尤为重要。

组织病理对真菌病的诊断具参考意义，HE染色、六胺银染色、PAS染色是真菌组织病理最常用的检测方法。HE染色对曲霉和结合菌、着色芽生菌等染色较好，不掩盖真菌本身的颜色，是必不可少的染色方法，但大多数真菌HE染色后，组织颜色与真菌颜色相近，不易分辨，为了更好的显示组织中的真菌，常需要其他特殊染色方法，如六胺银、PAS染色。六胺银能将真菌细胞壁着棕黑色，可清晰显示真菌轮廓与形态，但操作复杂，染液不能长期保存，且假阳性率较高。PAS染色可使真菌胞壁着色深红，胞质呈浅红，操作方法相对简单，但品红染液配制过程复杂，对配制器皿清洁度要求极高，极易配制失败，且染色过程耗时长，脱蜡进水后的切片，完成PAS染色平均时长约40分钟，且组织中含中性粘多糖的组织和细胞均着色容易形成共染现象，不易分辨，可能出现漏诊现象[2]。

与六胺银和PAS染色相比，免疫荧光染色检测能够高效、特异性地结合真菌细胞壁中的几丁质和纤维素的β葡聚糖等，在355 nm紫外光激发下与真菌结合的荧光染色剂会迅速发出亮蓝色荧光，与周围背景对比强烈，从而可以在荧光显微镜快速查找到真菌。国外免疫荧光染色早已广泛应用于真菌检测[3]。 而国内由于荧光显微镜的缺乏等，免疫荧光染色法在真菌病诊断上的应用起步较晚，目前应用石蜡包埋组织切片的检测研究较少[4，5]。本研究将临床确诊的43例皮肤真菌感染病例石蜡包埋切片进行免疫荧光染色，在皮肤组织中免疫荧光染色可以快速清晰显示真菌菌丝、孢子结构，较PAS染色阳性病例略有提高，但两者之间结果无统计学意义(P>0.05)，但将两种方法联合使用可明显提高真菌检出率(表2)。

表2 免疫荧光染色与PAS染色主要特点对比

为提高真菌免疫荧光染色的检出率，在免疫荧光染色过程中应注意：(1)需要有一定阅片经验的病理诊断医师结合HE染色正确判读，勿将背景中的胶原纤维或杂质误认为真菌菌丝孢子，可加入KOH溶液降低背景；(2)需多个切面观察，在操作过程中容易脱片，建议使用防脱切片且多切几个切面；(3)荧光染料试剂需避光保存，常温保存期一般为半年至一年；(4)荧光染色后容易发生减退或淬灭，染色后应立即放荧光显微镜下读片、拍照，切片无法长期保存。

综上所述，真菌免疫荧光染色在皮肤活检组织中是一种高效、快速、准确显示真菌菌丝孢子的检测方法，与PAS染色联合使用可明显提高真菌检出率，是提高皮肤真菌病真菌检出的重要补充方法，值得在皮肤真菌病检测中推广应用。