肠道菌群及其代谢产物在新生儿坏死性小肠结肠炎中研究现状与潜在应用思考

李禄全 刘晓晨

重庆医科大学附属儿童医院新生儿科 儿科学重庆市重点实验室 国家儿童健康与疾病临床医学研究中心 儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地 儿童发育疾病研究教育部重点实验室（重庆 400014）

坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是新生儿时期最常见及最严重的消化道炎症性疾病之一。早产儿NEC发病率为5.0%～12.0%[1]，在极低出生体重儿中发病率高达11.1%[2]。NEC病死率高达20.0%～30.0%，在需要外科手术治疗的人群中，其病死率更高[2]。同时，NEC是导致患儿远期智力发育落后的重要危险因素[3]。早期诊断有助于降低病死率，改善NEC 患儿预后。肠道菌群及其代谢产物是近年来研究的热点，肠道菌群通过激活肠道内的Toll 样受体4，引起肠上皮细胞凋亡增加，黏膜愈合受损和促炎因子释放，同时肠系膜血管收缩，引起局部缺血，导致NEC的发展[4-5]。在这一过程中，肠道菌群代谢产物（如短链脂肪酸）可以直接刺激肠上皮细胞或树突状细胞参与机体固有免疫反应，促进炎症因子释放，同时刺激宿主上皮细胞代谢降低氧浓度，加重肠道局部缺氧缺血[6-7]。本文主要探讨肠道菌群及其代谢产物在NEC中的临床应用潜在价值。

1 新生儿肠道菌群演化及其影响因素

人体肠道中细菌数在100 万亿左右，新生儿肠道菌群定植起始时间仍有争议，但越来越多的证据表明定植开始于胎儿期[8-9]。足月儿通过分娩时与母体产道和周围环境中菌群接触，生后最初几天肠道菌群包括需氧菌与兼性厌氧菌，随着肠道内氧气消耗，在生后1周左右，形成以拟杆菌、双歧杆菌、梭菌属细菌等厌氧菌为主的肠道菌群[10]，其中双歧杆菌在新生儿期和婴儿早期占主导地位[11]。与足月儿不同，早产儿肠道菌群多样性低于足月儿，且受胎龄与日龄影响较大[12]。早产儿出生时兼性厌氧菌（如肠杆菌科、肠球菌科和乳酸菌）水平增加，专性厌氧菌（如双歧杆菌属、拟杆菌属和异位芽胞杆菌属）水平降低。同时，其他潜在致病微生物群如肺炎克雷伯菌及大肠杆菌也增加。

新生儿肠道菌群从定植到成熟的过程受围生期和生命早期多种因素影响而动态变化。胎龄、分娩方式、喂养方式和产妇饮食、环境因素等可影响新生儿菌群定植[13]。如母乳喂养儿肠道菌群以双歧杆菌为主，而配方奶喂养者以大肠杆菌和梭菌属为主[14]。自然分娩新生儿肠道菌群组成与母体产道菌群相似，以乳酸杆菌、塞纳菌、普氏菌为主，而剖宫产者肠道菌群与母体皮肤定植菌群相似，以葡萄球菌、丙酸杆菌、棒状杆菌为主。其他因素（如长期住院、抗生素使用等）均可能影响肠道菌群。抗生素短期治疗（≤3 天）可导致肠道双歧杆菌减少并持续到生后第3周，长时间使用（≥5 天）则导致其减少,持续至生后第6 周[15]。资源匮乏、人满为患的卫生条件会导致新生儿肠道乳酸杆菌和双歧杆菌数量减少，而耐抗生素革兰阴性杆菌及梭菌数量增加[16-17]，住院时间超过1周，艰难梭菌定植增加27.5%，超过4周增加78.9%，超过7周增加100%[18]。

众多研究已表明肠道菌群是人类生长发育的重要因素，有助于建立免疫反应，在人类长期健康发展中起着重要作用[19-20]。研究这些因素对肠道菌群的影响将有助于评估肠道菌群的异常变化，进一步明确其变化在预测肠道疾病发生发展中的价值。

2 NEC新生儿肠道菌群变化

研究发现与健康新生儿相比，NEC 患儿肠道菌群生物多样性较低，α、β 多样性是研究NEC 菌群多样性最常用指标。α多样性常能够反映菌群的丰富度和均匀度，β多样性是表征个体间微生物群落结构相似性的指标。肠道菌群α多样性的下降以及β多样性分离对于NEC发病具有潜在预测价值，其变化可追溯到起病前1 周到3 周不等[21-26]。因此临床发现菌群多样改变时应提高警惕，早期采取预防措施，延缓病情进展。但因为菌群多样性监测困难，其临床应用价值不高，相比之下，具体的菌群变化更易监测，更具有临床应用潜力。

NEC 患儿在发病前，肠道菌群构成比例在门、属水平与正常新生儿相较均明显不同。在门水平上，变形菌门比例增加，厚壁菌门与拟杆菌门减少是NEC患儿发病前的重要特征[27-28]。在诊断前一周内，NEC 患儿厚壁菌门、拟杆菌门数量比例持续降低，而变形杆菌比例明显增加，而对照组四个主要菌门（厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和放线菌门）的比例在同一时期内无显著变化[25]。值得一提的是，NEC 发病前厚壁菌门和变形菌门变化可能与NEC发生时间有关。相关研究发现早发性NEC 患儿（生后20天内发病）发病前以厚壁菌门变化为主要表现，主要表现为梭状芽胞杆菌丰度增加，γ-变形菌门丰度降低。而晚发性NEC（生后20 天后发病）发病前以变形菌门变化为主，主要表现为γ-变形菌门的增加，大肠杆菌/志贺菌增加[29]。相比厚壁菌门和变形菌门，常被认为是“益生菌”的拟杆菌门和放线菌门在新生儿尤其是早产儿菌群中所占比例较低。研究发现，拟杆菌门[25,27,30]和放线菌门[26,31-32]在NEC发病前降低。

在属水平上，NEC 患儿出生时在菌属水平上异淋菌、赭杆菌、雷氏菌、外单胞菌、不动杆菌等的丰度远高于对照组，这一趋势一直持续到NEC 发生[13]。而常见的早期婴儿肠道共生菌，如放线菌属、沙利亚菌属、维洛内拉菌属、类杆菌属和链球菌属减少或缺失，这些共生菌早期丧失可能导致致病菌过度生长，从而诱发NEC[33]。NEC 发生前肠杆菌科中的克雷伯菌属、大肠杆菌属和肠杆菌属明显增加[5,25]。研究发现γ-变形杆菌与NEC风险增加之间存在关联，在极低出生体重儿NEC发病前，γ-蛋白杆菌相对丰富，严格厌氧菌（尤其是阴性菌）相对缺乏[34]。NEC 诊断时的菌群变化往往是发病前菌群失衡的集中体现，迄今为止进行的最大样本研究发现专性厌氧菌尤其是韦荣氏球菌属与NEC 显著相关[35]，但目前尚无统一结论说明哪种细菌与NEC 发病密切[36-37]。因此，明确这些菌群变化特征可为评估早产儿肠道菌群变化，预测NEC 发病提供重要参考依据。

3 NEC新生儿肠道菌群代谢产物变化

代谢组学是系统生物学的重要研究领域，其对生物样品中（如尿液和粪便）微生物代谢物进行定性和定量分析，不仅可以了解微生物的生理状态，还有助于阐明微生物与宿主之间的相互作用机制。在NEC 发病之前，患儿的肠道菌群代谢产物就已经出现改变[38]，目前研究主要集中在代谢相关酶活性、脂代谢及氨基酸代谢方面。既往研究大多仅仅关注分类学来寻找诊断/治疗性生物标志物，最近越来越多的研究强调了研究微生物代谢潜力的重要性[39]。

3.1 代谢有关酶改变

菌群改变可导致其调控的代谢途径中相关酶活性发生改变。在NEC 患儿粪便中几乎无法检测到与糖基化蛋白降解相关的α-岩藻糖苷酶和唾液酸酶。在NEC 患儿粪便中，参与菌群色氨酸代谢的关键酶（色氨酸酶和吲哚丙酮酸脱羧酶）比健康新生儿高3倍，而色氨酸2，3-二加氧酶比对照组低4倍[33]，这与NEC患儿中大肠杆菌、克雷伯菌和葡萄球菌属丰度增加相关。Sekar等[40]发现在NEC患者粪便样本中糖原脱支酶比对照组高10倍，这种酶参与糖原分解，可能导致病原体菌株毒力增强，这与NEC 粪便大肠杆菌和γ 变形杆菌类其他成员（如假单胞菌、克雷伯菌）的丰度相对增加一致。此外，研究发现在NEC发病前，与铁摄取和血红素降解有关的铁氧化酶和血红素加氧酶活性分别增加了45.0%和143.0%，其活性对革兰阴性病原体至关重要，有利于致病菌的生长繁殖[41]。也有研究发现NEC发生前肠道内L-乳酸脱氢酶和D-乳酸脱氢酶比对照组分别增加了373.0%和34.0%[27]，可能是因为广泛抗生素应用以及侵入性医疗操作导致肠道微生物群破坏，从而导致乳酸菌群的产生减少有关[42]。生物素对人体宿主的一系列分解代谢和合成代谢途径具有促进作用，它可以由健康婴儿肠道内富集的脆弱类杆菌在肠道合成，研究发现生物素（维生素B7）代谢相关酶，包括生物素连接酶、生物素羧化酶和生物素合酶，在NEC患者中的表达降低[33]。

3.2 氨基酸代谢有关改变

氨基酸作为机体代谢的重要物质，部分由细菌酶合成，参与肠道细菌的生物合成和正常代谢过程。相关研究发现发病当天NEC 患儿尿液中25 种代谢物在发病前与对照组存在显著差异，表现为丙氨酸、天冬酰胺和脯氨酸减少，精氨酸、苯丙氨酸升高[43]，提示NEC患儿存在氨基酸代谢异常。肠道代谢相关研究主要以粪便为主，但尿液不受排便次数影响是检测肠道微生物代谢的潜在替代方案。有研究评估了新生儿生后1 周内的尿液代谢组学改变发现，丙氨酸与厚壁菌门丰度呈正相关，而组氨酸与变形菌门和丙酸杆菌丰度呈负相关[44]，表明氨基酸代谢可反映肠道菌群的组成，其在NEC中的变化可能与菌群失调相关。

3.3 脂代谢有关改变

脂肪酸作为肠道内的主要能量来源，主要来自于食物，部分（如短链脂肪酸）可通过肠道菌群分解其他膳食纤维产生。研究发现，NEC 患儿粪便丁酸水平明显低于健康婴儿[45]，而丁酸主要由厚壁菌门产生，丁酸水平下降反映了NEC患儿肠道内的菌群紊乱，可能作为NEC 的特征性改变，具有潜在临床应用价值。除此之外，脂肪酸主要由肠道菌群分解代谢，不同肠道菌群代谢脂肪酸的途径不同，脂肪酸代谢途径异常可反映菌群异常。Stewart等[46]发现NEC 患儿两种来自C 21-类固醇激素生物合成和亚油酸代谢途径代谢物、两种来自亚油酸代谢途径的代谢物和一种来自白三烯代谢和前列腺素的代谢物在NEC 诊断前显著增高，在治疗后降低，其变化与双歧杆菌的变化高度相关。

综上，NEC患儿肠道菌群失调导致相关代谢通路酶及代谢产物异常，可作为开发NEC早期诊断的有价值微生物/代谢产物生物标记物的突破口。

4 菌群改变在NEC早期诊断中的价值

4.1 克雷伯菌

多项研究显示[21,25,27,30-31]，NEC 发病前变形菌门显著增加。相关研究发现在NEC前72小时至1周，变形菌门增加34.0%[25]。作为变形菌门的主要菌群，克雷伯菌的增加被认为与NEC发生密切相关，其在胎粪中已表现出差异，并持续到NEC 发病[5,30]。克雷伯氏菌在NEC 发病前12 天内显著增加[47]，Olm等[48]采用宏基因组分析160例早产儿的1 163份大便标本发现，超过52.0%的NEC患儿发病前样本中克雷伯氏菌属高于检测阈值，其与NEC发病最相关，进一步发现克雷伯氏菌的生物合成基因是NEC 发病前最重要的次生代谢物基因簇编码基因，具有较高质粒丰度，因此认为克雷伯氏菌丰度增高可作为NEC的最佳预测因子之一。

4.2 梭状芽胞杆菌和产气荚膜梭菌

Tarracchini 等[32]分析NEC 发病前以及未发生NEC 的早产儿肠道菌群，发现健康早产儿肠道中几乎不存在梭状芽胞杆菌和产气荚膜梭菌，而在NEC发病前的粪便中检测到这两者平均丰度分别为26.5%和6.9%。研究发现梭状芽孢杆菌在NEC发病前5 天开始增加，而产气荚膜梭菌在胎粪中便已开始增加并持续到NEC发病[30,34]。因此认为梭状芽胞杆菌和产气荚膜梭菌可作为早期预测NEC的潜在生物标志物[48]。

4.3 丙酸杆菌

相关研究对＜29 周胎龄早产儿人群粪便标本菌群分析发现，在生后4～9 天，18 例对照组患儿粪便样本中有10例发现了丙酸杆菌，但在后期发生NEC的9例患儿中均未发现丙酸杆菌，提示生后1周左右丙酸杆菌缺乏对后期发生NEC 可能具有重要预测价值[44]。

5 代谢产物在预测NEC方面的价值

5.1 氨基酸比例、鞘磷脂、酰基肉碱

Morrow 等[44]对11 例最终发生及21 例未发生NEC的新生儿的尿液样本进行分析后发现，丙氨酸与组氨酸的比率与NEC显著相关，在后期被诊断为NEC 的患儿中，其生后第4 至9 天尿液中丙氨酸和组氨酸浓度均明显升高，但当尿丙氨酸:组氨酸比值＞4时具有较好预测价值（灵敏度为82.0%，特异度为75.0%）。表明氨基酸比例失调在NEC 发病前已存在，对NEC 发病具有潜在预测价值。有研究发现NEC发生前1～5天NEC患儿粪便中鞘磷脂增加，进一步的分层聚类发现鞘磷脂有可能作为潜在广泛适用的预测性生物标记物[49]。另有研究发现生后12小时至8 天，14 个酰基肉碱水平和酰基肉碱比值与发生NEC 的风险增加相关，6 个乙酰肉碱水平联合出生体重和全肠外营养构建的模型可预测NEC 发病[50]，因此认为酰基肉碱水平和酰基肉碱比值可作为NEC发病的预测标志物。

5.2 自诱导分子2

自诱导分子2（autoinducer-2，AI-2）是重要的细菌群体感应系统信号分子，主要由LuxS基因编码，在许多不同的革兰阳性和阴性细菌中调节细菌毒力、生物膜形成、毒力因子的产生和释放等。笔者研究发现AI-2与NEC的发生和恢复显著相关，AI-2在NEC急性期显著下降，恢复期逐渐升高。此外，在疾病发展过程中，AI-2在细菌比例发生显著变化之前发生变化。这提示AI-2可能是NEC诊断和病情监测的新生标志物[51]。但目前相关研究仍较少，NEC发病和AI-2改变之间的因果关系尚不明确，AI-2早期预测NEC发病的价值仍需进一步研究。

5.3 挥发性有机化合物

挥发性有机化合物（volatile organic compounds，VOCs）是在常温下，沸点50～260 ℃的各种有机化合物，这些化合物在环境温度下易挥发。粪便中VOCs 被认为可提供有关肠道微生物群组成、代谢活性以及宿主与微生物群相互作用的信息。迄今为止，有3 项研究探索粪便VOCs 预测NEC 的潜力，De Meij 等[52]发现NEC 患儿粪便VOCs 谱在临床症状出现前2～3天与匹配的对照组有显著差异。而Probert[53]和Garner[54]则对NEC发病前4天的VOCs进行测定，前者发现NEC 发病前4 天甲基醛、3-甲基丁醛和2-甲基丁醛增加，3-甲基和2-甲基丁酸降低对于预测NEC发病的价值为中等。后者发现2-乙基己基乙酸酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯和十六酸乙酯在NEC 患儿粪便样本中缺失。这均提示粪便VOCs可用于早期识别NEC，可能成为早期预测NEC的无创工具。但相关研究较少且样本量较小，尚需高质量临床研究尽心验证。

6 结语

肠道菌群紊乱在NEC 发病中扮演了重要角色，肠道菌群的变化在一定程度上能够反映NEC的发病及严重程度。但需要注意的是，NEC 发病是整个肠道菌群共同变化的结果，单个细菌的改变很难作为评价标准，目前虽然有研究表明部分细菌在NEC发病中具有预测价值，但大多为单中心研究且样本量小，缺乏临床应用价值。而代谢产物是菌群与宿主沟通的桥梁，可反映整体肠道菌群的改变，可能在NEC 病情变化中更有价值。菌群蛋白质组学、代谢组学等相关研究在探寻NEC发病标志物中尚处于起步阶段，仍需要高质量、多中心、大样本量的临床研究进行验证。