COPD合并肺炎患者产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌基因型分析

白 燕，辜依海，刘玥彤，余宏鑫，贺 凡，孙德琴

肺炎是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)常见的并发症，同时也是导致COPD患者死亡的重要诱因[1]。流行病学调查显示，COPD患者合并肺部感染的发生率为3.9%，而肺部感染会使COPD患者病情进一步加重，其中细菌感染在COPD病情恶化过程中起着极其关键的作用[2]。肺炎克雷伯菌是COPD合并肺炎常见的致病菌，而随着抗生素在临床的大面积使用，肺炎克雷伯菌的耐药性不断升高，其中最重要的因素就是大量产生超广谱β-内酰胺酶(ESBLS)[3]。相关研究发现，不同地区的产ESBLS肺炎克雷伯菌存在一定的差异，其基因型并不相同，从而反映其耐药机制的复杂多样[4]。为详细了解COPD合并肺炎患者产ESBLS肺炎克雷伯菌的耐药性及其基因型，本研究通过对COPD合并肺炎患者的痰液标本进行细菌培养和鉴定，并分析产ESBLS肺炎克雷伯菌基因型分布情况，旨在为临床合理选择抗感染药物治疗COPD合并肺炎提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2018年1月—2020年1月我院收治的328例COPD合并肺炎作为研究对象，其中男201例，女127例；年龄45～72(60.91±8.36)岁；COPD病程5～16(11.58±2.31)年；来源于门诊33例，来源于住院病房295例。

1.2方法

1.2.1细菌培养、鉴定及药敏试验：采用一次性吸痰管收集所有患者的痰液标本，立即置于无菌管中，按照《全国临床检验操作规程》[5]中的方法进行细菌培养。使用API全自动微生物鉴定系统进行细菌鉴定，仪器购自法国生物梅里埃股份有限公司。Mueller-Hinton琼脂培养平板购自杭州天和微生物试剂有限公司。使用K-B纸片扩散法进行药敏试验，药敏试纸购自北京天坛药物生物技术开发公司。质控菌株为肺炎克雷伯菌ATCC700603及大肠埃希菌ATCC25922。选择氨苄西林、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、氨苄西林/舒巴坦、复方新诺明、庆大霉素、左氧氟沙星、环丙沙星、呋喃妥因、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、美罗培南及亚胺培南进行药敏试验。

1.2.2ESBLS检测：使用双纸片法及表型确证试验对肺炎克雷伯菌是否产ESBLS进行检测。应用无菌生理盐水稀释标本菌株悬浊液，直至0.5麦氏单位浊度，并且均匀地涂布于Mueller-Hinton琼脂培养平板上面；然后将30 μg的头孢他啶纸片、30 μg/10 μg的头孢他啶/克拉维酸纸片、30 μg的头孢噻肟纸片、30 μg/10 μg的头孢噻肟/克拉维酸纸片置于Mueller-Hinton琼脂培养平板上面；35 ℃条件下孵育16～18 h；测量头孢他啶纸片、头孢噻肟纸片，以及头孢他啶/克拉维酸纸片、头孢噻肟/克拉维酸纸片的抑菌环直径，若头孢他啶/克拉维酸纸片、头孢噻肟/克拉维酸纸片的抑菌环直径分别较头孢他啶纸片、头孢噻肟纸片抑菌环直径的扩大值≥5 mm，则明确为产ESBLS菌株。

1.2.3ESBLS基因型检测：首先，对产ESBLS肺炎克雷伯菌进行培养；然后提取产ESBLS肺炎克雷伯菌总DNA，再应用PCR法分析产ESBLS肺炎克雷伯菌基因型。PCR反应体系包括0.5 μmol/L上游引物、0.5 μmol/L下游引物、1 U Taq DNA聚合酶、1×PCR缓冲液以及100 ng DNA模板，总反应体积为25 μl；PCR反应程序为94 ℃预变性3 min、94 ℃变性30 s、60 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min、72 ℃延伸10 min，共25个循环。ESBLS基因型包括质粒诱导酶(TEM)、β-内酰胺耐药相关酶(SHV)、头孢噻肟酶(CTX-M)、邻氯青霉素水解酶(OXA)，各基因型引物序列见表1。

表1 ESBLS基因型引物序列

1.3观察指标 ①统计COPD合并肺炎患者肺炎克雷伯菌检出率；②记录COPD合并肺炎患者产ESBLS肺炎克雷伯菌对常用抗生素的耐药性；③分析COPD合并肺炎患者产ESBLS肺炎克雷伯菌基因型。

1.4统计学方法 应用SPSS 20.0统计学软件处理数据。耐药性检测结果、基因型分析结果等计数资料以率(%)表示。

2 结果

2.1肺炎克雷伯菌检出率 收集COPD合并肺炎患者痰液标本共328份，培养出病原菌131株，分离出肺炎克雷伯菌93株，共检出产ESBLS肺炎克雷伯菌48株，检出率为51.61%。

2.2产ESBLS肺炎克雷伯菌耐药性检测 药敏试验发现，COPD合并肺炎患者检出的48株产ESBLS肺炎克雷伯菌对氨苄西林、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶的耐药率均为100%；对氨苄西林/舒巴坦、复方新诺明耐药率均>60%，分别为68.75%和60.42%；对庆大霉素、左氧氟沙星、环丙沙星、呋喃妥因和哌拉西林/他唑巴坦的耐药率分别为39.58%、35.42%、35.42%、29.17%和20.83%；对阿米卡星的耐药率为8.33%，敏感性为91.67%；对亚胺培南和美罗培南耐药率均为0，敏感性为100%。

2.3产ESBLS肺炎克雷伯菌基因型分析 通过PCR法对48株产ESBLS肺炎克雷伯菌进行基因型分析，结果显示，3株为单基因型，其余为双基因型或多基因型，占比93.75%；48株产ESBLS肺炎克雷伯菌基因型以SHV、CTX-M-1为主，分别为38株(79.17%)、36株(75.00%)，基因型TEM、CTX-M-9、CTX-M-2、CTX-M-3、OXA分别为22株(45.83%)、11株(22.92%)、4株(8.33%)、3株(6.25%)、2株(4.17%)。见表2和图1。

表2 COPD合并肺炎患者产ESBLS肺炎克雷伯菌基因型分析(n=48)

图1 部分ESBLS基因型PCR扩增产物电泳图

3 讨论

COPD是一种全球负担巨大且日益严重的呼吸系统疾病，居全球死因的第三位[6-8]。肺部感染是导致COPD急性发作的重要因素，革兰阴性菌是COPD合并肺炎的主要病原菌[9-11]。一项关于COPD合并下呼吸道感染病原菌分布和耐药性的回顾性分析也发现，其主要病原菌为革兰阴性菌，且以肺炎克雷伯菌的检出率最高，占比30.3%[12]。但近年来，肺炎克雷伯菌由于产ESBLS而容易出现耐药性[13]。肺炎克雷伯菌耐药性增高不仅会使抗感染治疗失败，延长住院时间，增加经济负担，还会提升患者病死率[14-15]。

本研究结果显示，采集328份COPD合并肺炎患者痰液标本培养出病原菌131株，并分离出肺炎克雷伯菌93株，共检出产ESBLS肺炎克雷伯菌48株，检出率为51.61%，与相关文献报道相似[16-17]，但检出率较唐雯娟等[18]报道的29.57%及刘勇等[19]报道的37.65%明显升高。考虑与COPD患者免疫力较差，以及持续、大剂量地使用抗生素有关。提示COPD合并肺炎患者产ESBLS肺炎克雷伯菌现状已发展到较为严重的阶段，此问题迫切需要解决。本研究进一步药敏试验发现，COPD合并肺炎患者产ESBLS肺炎克雷伯菌除对亚胺培南、美罗培南、阿米卡星敏感性>90%以外，已对大部分的抗生素表现出耐药性，对氨苄西林、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶耐药率最高，达100%，其次为氨苄西林/舒巴坦、复方新诺明，耐药率均>60%，对庆大霉素、左氧氟沙星、环丙沙星、呋喃妥因、哌拉西林/他唑巴坦均表现出不同程度的耐药。具体而言，产ESBLS可能是肺炎克雷伯菌对大部分头孢菌素类药物产生耐药性的主要原因，如若长时间、高剂量地应用头孢菌素类药物，在药物的作用下，细菌ESBLS的产酶量将明显升高，从而造成肺炎克雷伯菌产生新的耐药性[20]。而肺炎克雷伯菌对亚胺培南、美罗培南等碳青霉烯类抗生素药物敏感性为100%，可能与此类药物对酶稳定性较好，且不容易被ESBLS所破坏存在关联，但随着碳青霉烯类抗生素不断地被临床经验性使用，其耐药性也在逐渐增加[21]。因此，针对产ESBLS肺炎克雷伯菌，选择抗生素时应当十分慎重。

本研究鉴定的48株产ESBLS肺炎克雷伯菌中，双基因型或多基因型占比93.75%，且以SHV、CTX-M-1基因型检出率最高，TEM、CTX-M-9次之，最后为CTX-M-2、CTX-M-3、OXA，与杨燕文等[22]报道的结果类似。表明产ESBLS肺炎克雷伯菌基因型呈现多样性，含多种产β-内酰胺酶基因的肺炎克雷伯菌耐药谱更宽，另外还可以通过质粒介导而使多重耐药菌传播与流行。基于COPD合并肺炎患者产ESBLS肺炎克雷伯菌基因型的复杂性及多样性，甚至呈现区域性流行状况，故不同地区需要加强对本地菌株耐药性的监测，从而及时预防、控制COPD合并肺炎患者产ESBLS肺炎克雷伯菌耐药性蔓延，并指导合理选择抗生素治疗。

综上所述，COPD合并肺炎患者产ESBLS肺炎克雷伯菌耐药状况控制差，菌株携带多种耐药基因现象较严重，需要引起高度重视。了解COPD合并肺炎患者产ESBLS肺炎克雷伯菌耐药状况以及菌株基因型分布，有利于预测COPD合并肺炎患者对抗生素的耐药趋势，进而指导临床合理应用抗生素进行治疗。