肉牛源产ESBLs肺炎克雷伯菌耐药基因检测

2022-10-21陈亮刘雪松冯万宇张蕾沈思思兰世捷李丹苗艳

畜牧兽医科学 2022年7期

陈亮，刘雪松，冯万宇，张蕾，沈思思，兰世捷，李丹，苗艳

（黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江齐齐哈尔 161005）

0 引言

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）属于肠杆菌科[1]，可以引起多种疾病，包括肺炎、膀胱炎、心内膜炎及败血症等[2]。随着抗生素的使用，细菌的耐药性问题逐渐暴露出来并且呈现出愈演愈烈的情况。第3代甚至第4代头孢菌素等β-内酰胺类抗生素被广泛应用在治疗革兰氏阴性菌的感染中。但是随着这些药物的使用，阴性杆菌的耐药性问题迅速增强。多种机制可引其革兰氏阴性杆菌产生β-内酰胺类药物耐药性，其中包括了编码PBPs的基因突变、主动外排泵作用、细胞膜通透性的改变及产生β-内酰胺酶[3]。其中产超广谱β-内酰胺酶（Extended-spectrum β-Lactamase）是导致阴性肠杆菌产生耐药性最为常见的机制之一[4]。超广谱β-内酰胺酶是由基因突变而产生的的一种酶，可水解β-内酰胺环，让药物失去活性。根据编码基因的不同，可将超广谱β-内酰胺酶分为TEM、CTX-M、SHV以及OXA等分型，其中TEM、CTX-M、SHV是常见的分型。CTX-M耐药基因存在多种亚型。

2021年10月从黑龙江省齐齐哈尔市周边肉牛场分离出一株致病性肺炎克雷伯菌，发现其对β-内酰胺类药物产生了强烈的耐药性，对其携带的耐药基因进行探究，为临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

致病性肺炎克雷伯君分离于黑龙江省齐齐哈尔周边肉牛场。

1.1.2 试剂与仪器

脑心浸出液培养基、MH琼脂培养基，均购自青岛海博生物技术有限公司。Taq Master Mix以及DNA Marker，购自大连Takara公司。Bio-Rad梯度PCR仪，购自伯乐生命医学产品有限公司。药敏纸片购自杭州滨河微生物试剂有限公司。

1.1.3 试验动物

清洁级昆明雌鼠6只，6周龄，体重大致在30～36 g，购自齐齐哈尔医学院实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 细菌纯化

将临床分离到的肺炎克雷伯菌划线接种到BHI琼脂培养基上，连续划线3代，将细菌进行纯化。

1.2.2 细菌致病性试验

将纯化后的细菌用BHI营养肉汤培养到1.5×108CFU/mL后，试验组3只小鼠腹腔注射0.2 mL。对照组3只注射无菌生理盐水。

1.2.3 药敏试验

根据CLSI的指导进行药敏试验。将细菌菌液培养到0.5麦氏单位，将菌液均匀涂抹于MH琼脂平板上，将药敏纸片均匀放置在平板上，2个药敏纸片间距不低于24 mm，一个平板上最多放置5个药敏纸片。

1.2.4 耐药基因检测

用DNA提取试剂盒提取DNA模板，进行耐药基因PCR检验。总体积为25 μL，其中模板2 μL，上下游引物各1 μL，Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。

2 结果

2.1 致病性试验

将分离得到的细菌经过纯培养后，对小鼠进行腹腔注射。试验小鼠在4 h内全部死亡，经过剖检发现死亡小鼠的脾脏、肝脏有出血点。将死亡小鼠进行心血涂片，镜检发现与克雷伯菌形态一致，该株细菌有致病性。

2.2 药敏试验

药敏试验看出该株致病性肺炎克雷伯菌对β-内酰胺类药物皆产生了耐药性，对氟喹诺酮类处于敏感状态。

2.3 耐药基因

耐药基因结果如图1所示，通过PCR发现该株菌株含有CTX-M-2基因，为携带CTX-M-2耐药基因的产超广谱β-内酰胺酶细菌。

图1 耐药基因PCR鉴定结果

3 讨论

克雷伯菌属为革兰氏阴性杆菌，其主要包含肺炎克雷伯菌、臭鼻克雷伯菌、鼻硬结克雷伯菌等。其中肺炎克雷伯菌的致病性较强，在多种动物中都曾分离出肺炎克雷伯菌。从陕西某规模化猪场中分理处一株具有致病性的肺炎克雷伯菌，并对其进行了药敏试验以及耐药基因的检测。从内蒙古通辽某羊场病死羊中分离出了一株致病性肺炎克雷伯菌，并对其携带的毒力基因进行了探究。从辽宁某小白鹅厂中分离出一株肺炎克雷伯菌，并对其致病性进行了探究。肺炎克雷伯菌分布广，并且致病动物种类多，对动物健康安全及公共卫生安全都造成了不小的威胁。随着抗生素的逐渐使用，细菌耐药性问题逐渐严重。其中肺炎克雷伯菌对β-内酰胺类药物的耐药性问题被许多研究人员关注。付霞丽对一株致病性猪源肺炎克雷伯菌的耐药基因携带情况进行了检测，发现其携带SHV耐药基因，为产超广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌。苏小艳对2株大熊猫源肺炎克雷伯菌的耐药基因进行了检测，发现其中一株细菌携带SHV+TEM+CTX-M-1耐药基因，另一株携带SHV+CTX-M-1耐药基因。从广东肇庆某猪场中分离出一株猪源肺炎克雷伯菌，经过耐药基因检测，发现其携带SHV耐药基因。面对着肺炎克雷伯菌如此严重的耐药性问题，研究人员提出了许多对应的解决方法。其中中药作为我国的瑰宝，其在联合抗生素治疗肺炎克雷伯菌以及逆转耐药性上起到了重要作用。金银花的有效成分绿原酸联合左氧氟沙星可有效对产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌的生物膜起到抑制作用，从而达到优良的抗菌效果。黄连素可有效抑制肺炎克雷伯菌的生长，并且可消除其耐药质粒，从而逆转其耐药性。清金化痰汤与头孢哌酮或舒巴坦联合应用对产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌在体外环境下具有明显的协同抑制作用。通过以上的报道可以看出，中药单独使用或者联合抗生素使用，对产超广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌具有良好的抗菌效果，并且能在一定程度上消除细菌的耐药质粒，扭转其耐药性。