清香型白酒酿造中乳酸乙酯和乙酸乙酯合成代谢调控的研究进展

2022-11-24李书婷黄志久吴正云贾代荣张文学

酿酒科技 2022年11期

李书婷，黄志久，吴正云，贾代荣，杨波，张文学

（1.四川大学轻工科学与工程学院，四川成都 610065；2.醉清风酒业股份有限公司，四川泸州 646000）

乙酸乙酯与乳酸乙酯是清香型白酒的主要香味物质，它们的含量和比例与清香型酒的风味品质密切相关[1]。乙酸乙酯偏低和乳酸乙酯偏高是影响清香型白酒品质的常见问题[2]。就乳酸乙酯而言，在白酒生产过程中，空气、酒曲、酒醅以及开放的发酵方式都可能带入乳酸菌，从而产生大量乳酸，导致乳酸乙酯含量上升[3-4]。目前降低乳酸乙酯含量的研究主要关注发酵环境和馏酒条件的优化[5]。在乙酸乙酯含量提高方面，主要采取筛选优良酵母菌株的方式。总体上看，从代谢调控角度探讨降低乳酸乙酯含量和提高乙酸乙酯含量的研究相对较少。本文综述了近年来清香型白酒中乳酸乙酯与乙酸乙酯合成代谢调控方面的研究进展，为提升清香型白酒品质提供理论参考。

1 白酒中乳酸乙酯和乙酸乙酯的合成途径

酿酒过程中，白酒中的乳酸乙酯和乙酸乙酯可通过化学反应或生物合成。生物合成又分为醇酰基转移酶途径和酯化酶途径。

1.1 化学反应

白酒发酵过程中会产生酸、醇等底物，酸与醇发生酯化反应生成酯类和水。酯化反应属于可逆反应，一般情况下反应不彻底并且速度极缓慢。在白酒发酵后期，酸、醇大量积累，有利于酯化反应的进行。白酒生产和贮藏过程中，可以通过延长发酵周期促使白酒中酯化反应达到平衡[6]。

1.2 醇酰基转移酶途径

醇酰基转移酶(Alcohol acetyl transferase)广泛存在于酵母、植物和细菌中[7]，能催化不同醇与酰基辅酶A 生成相应的酯类物质。目前关于植物来源的醇酰基转移酶研究已比较充分[8]。与酿酒相关的醇酰基转移酶主要存在于酵母[9]（包括酿酒酵母、克鲁维氏酵母、巴氏酵母等）中，目前的研究主要集中于酿酒酵母。酿酒酵母在发酵过程中不能合成乳酰CoA[10]，通过此途径合成的乳酸乙酯产量微乎其微。但对于乙酸乙酯而言醇酰基转移酶途径是主要合成途径[11-12]（图1）。与乙酸乙酯合成相关的醇酰基转移酶主要有Atf1p、Atf2p、Lg Atf1p[13-15]。研究表明，酿酒酵母中Atf1的敲除导致乙酸乙酯的形成减少40%，Atf2 的敲除仅导致乙酸乙酯减少13%，显示Atf1p 在乙酸乙酯的形成中作用更大[11，16]。此外，位于酵母线粒体中的醇酰基转移酶Eat1p 也可催化乙酰CoA 与乙醇反应生成乙酸乙酯[17]。Mans等[18]用CRISPR-Cas9 破坏酿酒酵母中Eat1p 同源物，乙酸乙酯的产量减少了50%。

图1 胞中乙酸乙酯合成的醇酰基转移酶途径[17，19]

1.3 酯化酶途径

酯化酶是催化合成低级脂肪酸酯酶类的总称，包括脂肪酶、酯合成酶和磷酸酯酶[20]。在白酒酿造中，酯化酶的产生菌主要是霉菌（红曲霉、毛霉、根霉等），其次为酵母菌（酿酒酵母、假丝酵母、球拟酵母等）[21]。目前关于酯化酶的研究大多集中于浓香型白酒中的己酸乙酯，武建国等[22]在酒醅中加入红曲酯化酶发酵后，己酸乙酯含量增加了124.8～162.5 mg/100 mL；许春艳等[23]发现紫色红曲霉YJX-8 酯化酶对己酸的酯化较对丁酸、乙酸的酯化作用更强；胡沂淮等[24]以洋河大曲中筛选到的紫红曲霉生产得到酯化红曲粗酶制剂，具有较高的己酸乙酯催化活性。酯化酶也能催化乙酸、乳酸等小分子酸与乙醇反应生成乙酸乙酯和乳酸乙酯等[21]。酯化酶的催化选择性在一定程度上受底物浓度和环境因子的影响，如对不同香型大曲酯化酶催化特性的研究显示，当乙酸浓度为25 g/L、pH4 时，催化合成乙酸乙酯的活力最高；当乳酸浓度为5 g/L、pH7 时，催化合成乳酸乙酯的活力最高[25]。由于酯化酶的种类繁多且催化特异性规律不完全清晰，目前很少有从酯化酶途径探讨白酒中乳酸乙酯与乙酸乙酯代谢调控的研究。深入探究各种酯化酶的催化特性和作用机制，对白酒酯类物质代谢调控的深入理解和实际应用有积极意义[26]。

2 乳酸乙酯与乙酸乙酯合成代谢的调控

乳酸乙酯在蒸酒前期温度较低、酒度较高时馏出较少；乙酸乙酯分子极性较小，较难溶于水，可以完全溶于乙醇，在蒸酒前期馏出相对较多[27-28]。因此可以采用高酒度摘酒方式降低成品酒中的乳酸乙酯含量。但此种方式会造成蒸馏后期其他重要风味物质的丢失，成品酒口感欠佳，减少原酒产量[3]。从代谢调控角度考虑，增加乙酸乙酯和减少乳酸乙酯含量的方式有以下几种。

2.1 改变前体物质的含量

乳酸乙酯通常是由乳酸菌代谢产生的乳酸和酵母菌代谢产生的乙醇作为前体物质合成，因此可以考虑通过降低前体物质乳酸的含量减少乳酸乙酯[29]的生成。乳酸降解菌（或称为乳酸利用菌）是能够利用乳酸作为碳源或者电子受体的一类微生物，最终降解产物有酯类、酸类和醇类[30]。目前已报道的乳酸降解菌有芽孢杆菌属、丙酸杆菌属、拟杆菌属和梭菌属等[30-32]。不同种属的菌株对乳酸的降解率差异很大，目前与芽孢杆菌有关的研究相对较多。镇达等[33]从大曲、黄水、酒醅中筛选到了16株可利用乳酸的芽孢杆菌；李伟等[34]从清香型大曲中筛选到两株芽孢杆菌B4-1 和B36-1，乳酸利用量分别达到1.91 g/L 和1.26 g/L；宋克伟等[35]将从清香型大曲中筛选到的枯草芽孢杆菌B001 添加到酒醅中进行发酵，乳酸乙酯降低了25%，并在感官品评中体现了清香型白酒爽净、柔顺等特点；杨望军[3]将从酒醅中筛选到的两株芽孢杆菌制成固体麸曲应用于生产，乳酸乙酯降低率分别为11.25 %和15.83%。从白酒生产环境中分离筛选乳酸降解菌添加到白酒发酵中，能够降低乳酸和乳酸乙酯含量，改善酒体品质，具有很好的应用前景[36]。

乙酸乙酯含量的提升可通过增加前体乙酸实现。王文阳等[37]在酒醅中添加3.0 mg 醋酸/g 醅的醋酸发酵液，白酒中的乙酸和乙酸乙酯含量分别提高了138.35 %和85.43 %；张华东等[38]在高粱汁培养基内接种不同浓度的醋酸菌悬浊液，探讨其对酿酒酵母酯醇代谢的影响，当醋酸菌接种量为3×109CFU/mL 时，乙酸乙酯含量增加12 %。醋酸菌是好氧微生物，随着发酵的进行，氧气耗尽，醋酸菌逐渐凋亡，因此添加醋酸菌悬浊液对提高乙酸乙酯含量的效果不及直接添加醋酸发酵液。

2.2 通过菌株选育提高乙酸乙酯含量

一般认为白酿酒造中的酵母菌与乙酸乙酯形成有密切关系，通过筛选高产乙酸乙酯的酵母菌株提高白酒中乙酸乙酯含量的研究报道较多。陈雪等[39]筛选到一株高产乙酸乙酯的酵母菌株，制成麸曲应用于高粱固态发酵试验，使乙酸乙酯的含量提高了19.5 %；程伟等[40]在清香型酒醅中筛选得到1株高产乙酸乙酯的酵母菌jmz-01，产乙酸乙酯能力为248.9 mg/L；许银等[41]将筛选到的酵母菌Y87与麸皮按质量比3∶100 添加到酒曲中，乙酸乙酯含量提高36.6 %；刘小改等[42]将筛选到的酵母菌J-4用于发酵，乙酸乙酯含量提高了50.7%。尽管筛选菌株的方法能有效提高成品酒中乙酸乙酯的含量，但其具体机制的研究报道很少。前文所述，醇酰基转移酶是乙酸乙酯合成的主要途径，猜测高产乙酸乙酯的菌株可能具有更高的醇酰基转移酶活性。

除筛选优良菌株之外，使用基因工程技术改造菌株也可以达到提高乙酸乙酯产量的效果，其主要原理是加强合成乙酸乙酯的醇酰基转移酶途径。Cui 等[43]在酿酒酵母中过表达醇酰基转移酶基因ATF1，产乙酸乙酯达270.24 mg/L，是亲本的27.21倍；Dong等[44]过表达酿酒酵母ATF1，使乙酸乙酯的产量从25.04 mg/L 提高到78.76 mg/L；Li 等[45-46]构建过量表达ATF1 和ATF2 的酿酒酵母菌株，乙酸乙酯产量分别达到1353.45 mg/L 和73.40 mg/L，是出发菌株的43.16 倍和2.34 倍；马红霞等[47]将过表达醇乙酰基转移酶的酿酒酵母MY15 应用于清香型白酒酿造,乙酸乙酯的总量提高了70%；Kruis 等[48]在酿酒酵母中过表达Eat 基因家族，15 个过表达菌株中有10 株显示乙酸乙酯的产量增加。尽管通过基因工程改造菌株能大幅度提高白酒中乙酸乙酯的含量，但目前此种方式在实际生产中的应用受到相关法规的限制。

2.3 添加乳酸菌及其代谢抑制剂降低乳酸乙酯含量

乳酸菌是酿酒过程中产生乳酸的主要微生物，因此可以考虑在酒醅中抑制乳酸菌生长从而减少乳酸的含量。龚士选[49]在西凤酒入池酒醅中加入3～5 kg/万斤酒醅的延胡索酸进行发酵实验，乳酸乙酯从150 mg/100 mL 降低至50～80 mg/100 mL，降乳效果明显，且酒质柔和，风格突出。乳酸菌生长的抑制剂很多，但选择性不强，可能扰乱正常的酿造发酵过程。如能寻找或开发出特异性的乳酸菌抑制剂，对于白酒生产中乳酸乙酯含量的降低更具有实际意义。

增强非乳酸代谢途径也是减少乳酸含量的方式之一。如添加琥珀酸脱氢酶的辅基黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），可以促进琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸，加速三羧酸循环，使代谢流向非乳酸生成途径。白希智等[50]将FAD 与大曲粉按比例混匀，添加到酒醅中，发酵40 d后，乳酸乙酯降低27.26%，己酸乙酯略有增加，对其他香味物质无明显影响，感官品评结果良好。目前在乳酸代谢抑制方面的主要方式是增强三羧酸循环，使丙酮酸更多流向非乳酸代谢途径，但这一方式在厌氧发酵条件下的应用受到限制。