酱香大曲中高产四甲基吡嗪微生物的选育及应用研究

范恩帝，黄 魏，谢 丹，吴 成，李岭卓，张 健，尤小龙，程平言，胡 峰

（贵州茅台酒厂（集团）习酒有限责任公司，贵州习水 564622）

作为三大主要香型白酒之一的酱香型白酒，因其独特的工艺和风味闻名于世[1]。四甲基吡嗪作为川芎主要活性成分，也被称为川芎嗪，是一类广泛存在于食品中的生物碱[2]。酱香型白酒中的四甲基吡嗪不但可以起到减轻炎症和抑制肿瘤等作用[3-4]，更能赋予其烘烤香气，是形成酱香风味的重要成分[5-6]。因此，在大健康主题作为民生要点备受政府和社会关注的时代下[7]，研究增加酱香型白酒中四甲基吡嗪含量对于改善和提高其品质具有重要意义。

食品中的四甲基吡嗪多产生于美拉德反应[8]，但有研究表明酱香型白酒中的四甲基吡嗪主要是通过枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等微生物产生[9-11]。芽孢杆菌作为酱香型白酒生产过程中产生酱香风味的主要微生物，可以产生3-羟基丁酮（也叫乙偶姻）等风味物质[12-13]，还可代谢产生蛋白酶把蛋白质降解为氨基酸[9-10]，氨基酸在氨基酸脱氢酶作用下继续脱氢产生的氨与其代谢产物3-羟基丁酮发生非酶促反应合成四甲基吡嗪[11，14]。有研究指出在酱香型白酒生产过程中大曲是细菌的主要来源[15]。鉴于此，可通过初步筛选大曲中高产乙偶姻和蛋白酶的芽孢杆菌，再从中筛选高产四甲基吡嗪的芽孢杆菌，用以制作功能性大曲并运用于酱香型白酒生产，进而提高四甲基吡嗪的含量。本研究以成品酱香大曲为研究对象，经高温高渗条件富集芽孢杆菌，再通过V-P 反应和产蛋白酶能力初筛得到3-羟基丁酮（作为四甲基吡嗪前体物质）和蛋白酶产量较高的芽孢杆菌[16-17]，进一步发酵和对比各菌株四甲基吡嗪产量最终筛选出高产四甲基吡嗪的微生物。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 样品

酱香大曲：贵州某酱香型白酒公司提供的储存半年后成品粉碎曲和曲块。

1.1.2 试剂及耗材

色谱纯四甲基吡嗪，上海安谱实验科技股份有限公司；肌酸，成都西亚化工股份有限公司；酵母浸粉，OXOID；蛋白胨、牛肉膏粉，北京奥博星生物技术有限责任公司；氢氧化钠、氯化钠、葡萄糖、牛肉膏，国药集团化学试剂有限公司；磷酸氢二钠，天津大茂化学试剂厂；酪蛋白、磷酸氢二铵，北京索莱宝科技有限公司。

1.1.3 培养基

营养琼脂培养基：蛋白胨10g，牛肉膏粉3 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，加入1 mL 浓度为0.04 g/mL 的溴甲酚紫乙醇溶液，蒸馏水定容至1000 mL，调节pH7.3，121 ℃灭菌20 min。

高盐琼脂培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏粉3 g，氯化钠100 g，琼脂20 g，加入1 mL 浓度为0.04 g/mL的溴甲酚紫乙醇溶液，蒸馏水定容至1000 mL,调节pH7.3，121 ℃灭菌20 min。

V-P培养基：葡萄糖5 g，蛋白胨5 g，氯化钠5 g，蒸馏水定容至1000 mL，调节pH7.2，121 ℃灭菌20 min。

酪蛋白琼脂培养基：酪蛋白10g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，磷酸氢二钠2 g，琼脂20 g，蒸馏水定容至1000 mL，并调节pH7.0～7.2，121 ℃灭菌20 min。

芽孢杆菌培养基（LB 培养基）：酵母浸粉5 g，氯化钠10 g，蛋白胨10 g，蒸馏水定容至1000 mL，调节pH7.4，121 ℃灭菌20 min。

发酵培养基（YPG 培养基）：葡萄糖100 g，蛋白胨30 g，酵母膏10 g，磷酸氢二铵30 g，蒸馏水定容至1000 mL，调节pH7.5，115 ℃灭菌15 min。

1.1.4 仪器设备

全温震荡培养箱（ZQPL-200 型），天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；海尔-20 ℃低温保藏箱（DW-30L278），青岛海尔生物医疗股份有限公司；超纯水器（AWL-1001-P），艾科浦公司；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9075A 型），上海一恒科学仪器有限公司；无菌操作台（SW-CJ-2F），苏州净化设备有限公司；生化培养箱（LRH-250），上海一恒科学仪器有限公司；高压蒸汽灭菌锅（CL-32L），KAGOSHIMA SEISAKUSYO INC；高效液相色谱仪（安捷伦1260），安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芽孢杆菌富集

对大曲样品进行粉碎，每个样品均取两份含量为25 g 的曲粉，分别置于100 mL 的生理盐水和LB培养基中。将生理盐水样品于37 ℃、150 r/min 摇床中振荡30 min，稀释涂布于营养琼脂培养基和高盐培养基中，将营养琼脂培养基置于45 ℃培养箱中培养1 d，将高盐培养基置于37 ℃培养箱中培养1 d。LB 培养基样品于37 ℃、150 r/min摇床中培养1 d后，置于100 ℃水浴锅中水浴30 min，稀释涂布于营养琼脂培养基，置于37 ℃培养箱中培养1 d[18]。最后再对各平板微生物进行多次纯化并保藏。

1.2.2 菌种初筛

将上述微生物活化后接种于V-P 培养基，37 ℃培养箱中培养2 d，将活化后的微生物点接到酪蛋白琼脂培养基，37 ℃培养箱中培养1 d，通过V-P 反应中吸光度判断各微生物乙偶姻产生能力，通过酪蛋白琼脂培养基透明圈直径判断各微生物产蛋白酶能力。以产乙偶姻能力为主，产蛋白酶能力为辅，筛选出乙偶姻和蛋白酶产量较优的微生物。

1.2.3 菌种复筛

将1.2.2 得到的微生物分别接种到YPG 培养基中，置于37 ℃、180 r/min 摇床中发酵3 d，根据各微生物发酵液中四甲基吡嗪浓度筛选出高产四甲基吡嗪微生物。

1.2.4 菌种鉴定

形态鉴定：观察菌落表面形状、大小、颜色和边缘等特征，并通过显微镜观察微观形态[19]。

分子生物学鉴定：对微生物进行16S rDNA 测序[20]，利用NCBI 中的在线工具Blast 将获得的基因序列与GenBank 中的标准菌株进行比对，选取同源性高于99 %的部分具有代表性的物种，通过软件MEGA X 选择Neighbor-Joining 模型构建系统发育树，进行同源性分析。

1.2.5 高产四甲基吡嗪微生物的模拟应用

称取若干小麦置于锥形瓶中进行灭菌，按照7%的比例加入母曲，接入10%的高产四甲基吡嗪微生物菌液，置于37 ℃培养箱中培养4 d，对发酵物进行香气评价和四甲基吡嗪含量检测。

1.2.6 测定分析方法

乙偶姻含量粗测采用V-P 反应和光度法[21]。四甲基吡嗪含量测定采用高效液相色谱法[22]，液态发酵样品稀释10倍后进行检测，固态发酵样品先于12%乙醇溶液中浸泡10 min，再超声处理30 min，最后离心进行检测。

2 结果与分析

2.1 高产四甲基吡嗪微生物初筛

酱香型白酒四甲基吡嗪多由微生物产生，乙偶姻是微生物合成四甲基吡嗪的前体物质[23]，可通过V-P 反应后的吸光度大小判断微生物产乙偶姻能力强弱，蛋白酶可以把蛋白质降解为氨基酸，为四甲基吡嗪合成提供前体物质，可根据酪蛋白培养基上透明圈大小判断产蛋白酶能力强弱。因此本研究从富集纯化的38 株微生物中筛选高产乙偶姻和蛋白酶微生物，进而筛选四甲基吡嗪产量高的微生物，初筛结果见图1和图2。

由图1 和图2 可以看出，在所有菌株中，JPF1、JPF2、△JPF1、JYF1、△JYF1和JM4这6株菌株既能产生较高含量的乙偶姻，又能产生丰富的蛋白酶，具有高产四甲基吡嗪的潜力，因此将这些菌株作为待定菌株，并通过后续发酵实验进一步筛选目标微生物。

图1 不同菌株产乙偶姻能力

图2 不同菌株产蛋白酶能力

2.2 高产四甲基吡嗪微生物复筛

基于产乙偶姻能力和产蛋白酶能力初筛得到的JPF1、JPF2、△JPF1、JYF1、△JYF1 和JM4，通过进一步发酵实验以筛选高产四甲基吡嗪微生物，结果见图3。

根据图3 结果可以看出，菌株△JYF1 四甲基吡嗪产量为424 mg/L，明显高于其余菌株，尤其是JPF2、△JPF1、JYF1、JM4。结合初筛结果可以发现产乙偶姻能力强的菌株（JPF1 和△JYF1）在四甲基吡嗪产量上具有更好表现，说明较高产量的前体物质（乙偶姻）对四甲基吡嗪的产生有一定助益。

图3 不同菌株四甲基吡嗪产量

2.3 微生物鉴定

2.3.1 微生物形态学观察

将筛选的菌株△JYF1 分别接种于营养琼脂培养基和LB 培养基上培养1 d，对其宏观菌落形态和微观细胞形态进行观察，结果如图4所示。

从图4 可以看出，菌株△JYF1 菌落在营养琼脂培养基上呈扁平的白色椭圆形，表面粗糙干燥不透明，边缘呈啮齿状；LB 培养基中菌株△JYF1 经适当稀释并染色后通过显微镜进行观察，菌株细胞形态为短杆状。

图4 菌株△JYF1菌落形态（a）及细胞形态（b）

2.3.2 微生物分子生物学鉴定

对筛选得到的菌株△JYF1 进行16S rDNA 测序，利用NCBI 中的在线工具Blast 将测序获得的基因序列与GenBank 中的标准菌株进行比对，选取同源性高于99 %的部分具有代表性的物种，并通过软件MEGA X 选择Neighbor-Joining 模型构建系统发育树，结果如图5所示。

从图5 可以看出，菌株△JYF1 与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、贝莱斯芽孢杆菌（B.velezensis）和西姆芽孢杆菌（B.siamensis）等多种芽孢杆菌同源性均大于99%，其中，西姆芽孢杆菌与菌株△JYF1 处于同一分支，结合对菌株△JYF1 的形态学观察，故可鉴定其为西姆芽孢杆菌。

图5 菌株△JYF1基于16S rDNA序列的系统发育树

2.4 高产四甲基吡嗪微生物的模拟应用

为了探究高产四甲基吡嗪微生物对酱香大曲生产的影响，本研究设置三组实验（未接种小麦组、加母曲小麦组、加母曲和菌液小麦组）进行对比，结果见表1。

由表1 可看出，相较于未接种小麦组和加母曲小麦组，加母曲和菌液小麦组既能产生较高含量的四甲基吡嗪，又具有酱香味和酒香味，说明单独加入母曲的小麦在短时间发酵过程中仅有霉菌较为活跃，无四甲基吡嗪产生，加入母曲和菌液则可以加速四甲基吡嗪的产生。同时也说明高产蛋白酶的菌株△JYF1 可以降解小麦，有益于母曲中酵母等微生物在小麦中的生长繁殖。

表1 功能微生物对小麦发酵的影响

3 结论

本研究从酱香大曲中初筛得到6 株高产乙偶姻和蛋白酶的微生物，并通过进一步发酵从中筛选到1 株四甲基吡嗪生成能力较强的芽孢杆菌△JYF1。在YPG发酵培养基中该菌株四甲基吡嗪产量可以达到424 mg/L，与目前已报道的相关研究相比产量更高[2，24，25]。通过对其进行形态学观察和分子生物学鉴定，鉴定为西姆芽孢杆菌。菌株△JYF1 应用于酱香大曲模拟生产时，可大大加速四甲基吡嗪的产生，发酵4 d 后的产物中四甲基吡嗪产量可以达到65.51 mg/kg，在同类研究中处于较高水平[26]，同时还具有浓郁的酱香味。该菌株的成功筛选为提高酱香白酒中四甲基吡嗪含量提供了可能，但其实际推广应用还有待进一步的中试实验和大试实验加以验证。