新型冠状病毒实验室检测技术的研究

李 丽

（贵州中医药大学第一附属医院检验科，贵州 贵阳 550001）

2019 年年底以来，新型冠状病毒(SARSCoV-2) 感染引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19) 在全球范围内迅速蔓延。2020 年1月11 日首个新型冠状病毒基因组序列(Genbank登记号MN908947) 公布，各地区重点实验室迅速制定了针对新型冠状病毒感染的标准化实验室诊断方案，并推荐了合适的引物、探针和热循环条件。配备了扩增前、扩增中和扩增后标准化分区的实验室能快速检测新型冠状病毒。这为随后临床上大量出现的“新型冠状病毒快速检测”奠定了基础，这些检测技术各不相同，从新型冠状病毒抗原、抗体、抗原和抗体的组合检测，到核酸扩增检测。它们的检测目标和性能特征也各不相同。实验室诊断检测的应用场景包括无症状人群筛查、有针对性的高危人群筛查、接触者调查、临床诊断、疾病严重程度监测、传染性监测及回顾性全人群筛查等。然而，没有一种单独的检测方法能够同时满足上文提到的所有应用场景的需求。在本文中，笔者主要是对新型冠状病毒实验室检测技术的研究进展进行综述。

1 不同类型样本的检测性能

COVID-19 是一种主要攻击人类或动物呼吸道的病毒感染性疾病。诊断此病时标本的选择取决于检测环境、疾病阶段及临床特征。目前临床上主要是将上、下呼吸道标本的病毒检测作为诊断新型冠状病毒临床活动性感染的主要手段。另外，血清和粪便标本也可用于检测新型冠状病毒。

1.1 上呼吸道标本的检测性能

临床上常用的上呼吸道标本包含鼻咽拭子、鼻咽吸液、口咽( 咽喉) 拭子、前鼻拭子、中鼻甲拭子、唾液标本等。上述标本除前鼻、中鼻甲拭子和唾液标本可由患者自行采集外，其余标本均需由医护人员采集[1]。上呼吸道标本可用于早期感染有症状或无症状活动性呼吸道疾病的临床诊断。鼻咽部标本，特别是鼻咽部分泌物(NPA)标本是诊断呼吸道病毒感染的首选标本，其对病毒的检出率最高。但由于在抽吸收集NPA 过程中存在产生气溶胶的潜在风险，我们不建议在COVID-19 的临床诊断中收集NPA。鼻咽拭子是一种很好的可替代NPA 的标本，其能够得出比口咽拭子更可靠的检测结果[2]。为进一步提高COVID-19 的诊断准确率，鼻咽拭子和口咽拭子结合标本是目前诊断COVID-19 活动性感染最常用的标本类型之一[3]。前鼻、中鼻甲拭子和唾液标本可由患者自行收集，上述标本在医护人员个人防护装备供应不足的情况下具有明显的应用优势（不需要医护人员收集）。多项研究表明，用深喉唾液标本检测呼吸道病毒感染的敏感性可与鼻咽拭子标本相媲美[3-4]。但目前世界卫生组织仍不建议使用唾液标本诊断COVID-19。

1.2 下呼吸道标本的检测性能

与上呼吸道标本相比，下呼吸道标本具有更高的病毒载量，更有可能产生阳性检测反应[2]。对于处于COVID-19 病程后期的患者或临床高度怀疑但上呼吸道标本检测结果为阴性的患者，建议使用下呼吸道标本诊断其病情[3]。在采集下呼吸道标本时，不建议采集诱导痰。这是因为，进行上述操作的过程中会产生气溶胶，从而可使医护人员处于危险中。在适当的环境下( 如通风良好的负压室)，对于接受闭环机械通气的重症患者，可在严格遵守医院感染控制规范的情况下采集其气管内抽吸物和支气管肺泡灌洗液进行检测。

1.3 血液标本的检测性能

新型冠状病毒很少能在血液标本中检测到，血液新型冠状病毒检测对COVID-19 临床诊断的帮助有限[5]。在COVID-19 的急性期，间隔2 ～4周采集的配对血清样本可用于检测抗体滴度升高4 倍的情况。然而，血清学检测不能作为急性新型冠状病毒感染的独立诊断依据。

1.4 粪便标本的检测性能

新型冠状病毒可存在于COVID-19 患者的粪便中。在发病2 周后，病情越严重的COVID-19患者其粪便中出现新型冠状病毒的可能性就越大[6]。重症监护患者肛门拭子中发现新型冠状病毒是导致其死亡的危险因素。对于临床表现高度可疑但呼吸道标本检测结果为阴性的患者，粪便标本检测可作为辅助诊断其病情的手段。

2 实验室检测技术

2.1 核酸扩增试验(NAAT)

NAAT 是诊断COVID-19 的首选技术。在诊断COVID-19 时，采用实时聚合酶链式反应法检测上呼吸道标本中的新型冠状病毒RNA 是首选的初步诊断试验。目前，环介导等温扩增(LAMP)和CRISPR 等其他NAAT 技术也已在新型冠状病毒的检测中得到应用。进行新型冠状病毒NAAT检测时检测目标是新型冠状病毒的核衣壳(N)、包膜(E)、刺突(S) 基因和RNA 聚合酶基因。在进行相关检测时，理想情况下应选择两个独立的基因靶点，因为单靶点检测的性能可能会受到病毒突变的影响。在对疑似COVID-19 患者进行新型冠状病毒NAAT 检测时，样本- 应答检验是否优于标准分子检验尚无强有力的证据，建议检验人员可结合资源供给、样本量大小和所需的周转时间选择相应的检验方法。

2.2 抗原检测

抗原检测法（基于免疫技术采用不同的检测方法，如横向流动夹心免疫分析法、微流体免疫荧光分析法和色谱数字免疫分析法）可检测出呼吸道标本中新型冠状病毒的蛋白。该检测方法易于操作，可用于床旁检测(POCT)，因此也被称为快速诊断试验（可以在15 ～30 min 内获得检测结果）。病毒核衣壳蛋白是最常用的抗原检测靶点，因为它在临床样本中的含量最丰富且不涉及靶蛋白扩增。据报道，进行上述抗原检测的特异性很高(＞97%)[7]。与需要特殊设备的NAAT 检测相比，抗原检测的优点是操作简单。世界卫生组织建议在无法获得NAAT 检测相关设备或周转时间延长影响临床使用的情况下（在患者出现相关症状后的第5 d ～第7 d 内）可采用抗原检测法检测新型冠状病毒。

2.3 抗体检测

非定量抗体检测在流行病学调查中非常重要，它可以确定特定人群的发病率，可以检测抗体滴度的变化。有研究指出，抗体检测可在急性新型冠状病毒感染的诊断中发挥重要作用。抗体检测通常是针对核衣壳(N)、刺突(S) 蛋白这两种抗原。在实验室抗体检测中，酶联免疫吸附试验(ELISA)和化学发光免疫试验(CLIA) 是最常用的检测技术。此外，横向流动免疫分析、胶体金或荧光标记技术也是常用的检测技术。在进行相关检测前，应了解各检测技术的性能特点，并进行内部验证检测。进行抗体检测通常是检测IgG、IgM、IgA 等抗体、总免疫球蛋白或上述抗体的各种组合。一般来说，IgG 抗体或总免疫球蛋白检测的准确性高于IgM 抗体、IgA 抗体或IgM/IgG 抗体检测的准确性。为了提高血清学抗体检测的准确性，美国疾病控制与预防中心提出了两步检测法，即对两种不同的抗体进行检测，若首次检测阳性，就通过对另一种抗体的检测来进行复核。在新型冠状病毒感染后的最初几天到几周内，进行血清学抗体检测通常无法检出相关抗体，故此检测方法在新型冠状病毒感染急性期诊断中的应用价值十分有限。但在患者出现症状3 ～4 周后进行血清学抗体检测的准确性较高。

3 检测性能和结果分析

在美国，从上呼吸道标本中检测新型冠状病毒RNA 被认为是初步诊断COVID-19 的首选检测方法[4]。在无法进行NAAT 检测的情况下，抗原检测可作为最初的检测。但如上文所述，抗原检测的敏感性低于NAAT 检测，若临床可疑患者的抗原检测结果呈阴性，则应进行NAAT 检测予以确认。NAAT 检测阳性一般可确诊为COVID-19。在患者出现症状后数周内持续检测新型冠状病毒的RNA，可检测到非活病毒片段（无传染性）[8]。NAAT 检测结果可能出现假阴性，可考虑在初次检测24 ～48 h 后进行复检，特别是有下呼吸道感染证据时可保存下呼吸道标本，以供复检。建议在出具实验室检测结果时要谨慎。当检测结果与临床表现不符时，或NAAT 检测结果呈弱阳性、Ct 值高或溶解曲线异常时，应重新取样复检。复检可通过替代NAAT 检测进行，若两种不同检测的结果矛盾时应寻求参考其他实验室检查结果予以确认。检测结果为阴性时并不一定能排除感染[9]，导致假阴性结果出现的原因可来源于分析前步骤（如标本采集不当）、分析中步骤（如PCR 抑制或靶基因突变）或分析后步骤（如转录错误等）[10]。

4 小结

当前全球COVID-19 疫情非常严峻，准确地诊断COVID-19 对其传播的遏制和临床管理而言至关重要。目前诊断COVID-19 的金标准仍然是采用NAAT 技术检测呼吸道标本中的新型冠状病毒，但在资源匮乏地区此方法的应用受限。在此类地区，可尝试采用抗原和抗体检测替代NAAT 检测，但应意识到其局限性。综上所述，笔者认为研究硬件要求低、周转时间快和检测性能良好的新诊断技术对控制COVID-19 的流行而言十分重要。