新型尿脱落细胞学检查方法诊断尿路上皮癌的临床研究

陈宇豪 徐锋 刘娓 刘喆 王祖恒 黄杰 程文

尿脱落细胞学检查方法是临床上应用最广泛的用于诊断尿路上皮癌的检查方法，早期的直接涂片显微镜镜检法单次的敏感性约为13%～75%[1]，临床上逐渐被新柏氏液基细胞学检查(thinprep cytologic test, TCT)方法所替代。TCT法继承了传统脱落细胞学检查特异性高、经济简便、诊断高级别肿瘤及原位癌阳性率高的特点，并且在制片质量上有较大提升[2]。但是，TCT法在实际操作中面临尿液黏液、红细胞和无机盐结晶无法有效去除、细胞提取率不高、细胞难以全部转移至玻片上等问题，尤其是难以处理细胞和组织团块粘连堆积的样本。我们在前人研究的基础上设计了一种新型尿脱落细胞学检查方法，并与TCT法进行比较，验证其在尿路上皮癌中的应用价值。

对象与方法

一、临床资料

收集南京大学医学院附属金陵医院(东部战区总医院)2018年6月至2019年10月期间收治的91例因影像学结果或无痛性肉眼血尿怀疑有尿路上皮癌患者的临床资料，所有患者未留置导尿管，均在膀胱镜检查之前收集尿液样本。其中男71例，女20例，年龄41～85岁，平均(65.3±11.3)岁，91例患者均采用新型尿脱落细胞学方法和TCT法检查。

二、操作方法

新型尿脱落细胞学检查方法：提前嘱患者晨起适当多饮水，收集每位患者晨起第1次小便至送检前至少两次尿液置于550 ml矿泉水瓶中，尿液总量均不少于250 ml，确保标本无污染。步骤如下：①在矿泉水瓶内注入40 ml生理盐水，并在液面高度瓶壁外侧用注射器针头扎一小孔并用一次性胶布封闭小孔，倒出生理盐水。将尿液标本置入该矿泉水瓶中静置1 h后去除胶布，待上层液体流出后，摇匀沉淀物后均分至5 ml离心管，用10 ml生理盐水洗净附壁沉渣一并倒入离心管(离心管共10支)。②使用离心机以2 000转/min的速率离心5 min，弃上清液。③加入适量5%醋酸溶液以裂解红细胞、黏液和无机盐结晶，充分震荡，静置3 min后，以2 000转/min离心5 min，弃上清液。若血尿较重或黏液较多，可重复此步骤。④加入0.9%生理盐水，充分震荡后，以2 000转/min离心5 min，弃上清液。最后加入10%甲醛溶液，并将全部沉淀物集中至试管中暂时封存。⑤制片前将标本以1 000转/min速率离心，用滤纸过滤后将全部沉淀物包好放入包埋盒中，用脱水机常规脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋。对于细胞量较少或者底部细胞难以聚集的样本，用滴管吸取下层沉淀物，滴到提前加热至65 ℃熔化的琼脂凝胶上，冷却后将固体琼脂凝胶置入包埋盒中，脱水、透明、浸蜡包埋。⑥蜡块首次切片5张，脱蜡后行苏木精-伊红染色，并封片。阅片后若均为阴性结果，采用连续切片法，直至将蜡块全部切片、染色、封片并阅片。

TCT法：收集患者第2次晨尿中段尿送检(约50 ml)。步骤如下：①尿液标本全部转移至50 ml离心管，使用离心机以2 000转/min的速率离心5 min，弃上清液。②加入清洗液30 ml，震荡后使用离心机继续以2 000转/min的速率离心5 min，弃上清液。③倒入新柏氏保存液，静置15 min后，使用新柏氏T5000全自动液基薄层细胞制片仪制片，所获取的细胞标本采用苏木精-伊红染色，封片。

三、结果判定

所有切片均由细胞病理学医师阅片。明确癌细胞的诊断标准如下：①对于标本中小块恶性组织的诊断，我们将以下结果归为明确癌细胞：细胞层次明显增多；细胞排列紊乱；细胞核增大、核浆比例失调；可见核仁增多、增大或巨大核仁；细胞突破基底膜；病理性核分裂。②对于沉渣中恶性细胞的诊断，我们将以下结果归为明确癌细胞：细胞体增大、核浆比例高度失调；核染色质高度分布不均；巨大裸核；核仁明显增多、增大或巨大核仁；出现多核、巨核细胞；病理性核分裂。实际操作可能出现的情况主要有以下4种：①正常上皮细胞；②非典型上皮细胞(异型性上皮细胞缺乏明确恶性特征)；③可疑癌细胞(上皮细胞有恶性特征，数量或质量不足以诊断为癌)；④明确癌细胞。我们将满足①和②的样本判定为阴性结果，分别记为1分和2分，将③和④判定为阳性结果，分别记为3分和4分。

四、统计学方法

采用SPSS 23.0软件进行数据分析，样本总频数>40且单个频数>5时采用卡方检验；总频数>40，但有单个频数<5采用卡方矫正公式检验；总频数<40且有单体频数<5则采用Fisher’s确切概率法，P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、结果汇总

在91例患者中，确诊为膀胱肿瘤的患者52例，其中包括50例尿路上皮癌、1例肾源性腺瘤、1例黏液腺癌，确诊为输尿管癌或者肾盂癌的患者24例。另有1例尿路上皮不典型增生，3例腺性膀胱炎，1例膀胱结石，4例前列腺增生或前列腺癌，5例肾细胞癌和1例淋巴瘤。在诊断为尿路上皮癌的74例患者中，高级别尿路上皮癌54例，低级别尿路上皮癌20例；肌层浸润性尿路上皮癌44例，非肌层浸润性尿路上皮癌30例；男54例，女20例；首发患者63例，复发患者11例。

在91例疑似尿路上皮癌的尿液样本中，新型尿脱落细胞学检查方法检测出48例阳性，其中1例阳性的病理结果为膀胱肾源性腺瘤，1例阳性的病理结果为上皮不典型增生。TCT法检测出34例阳性，其中1例阳性的病理结果为肾细胞癌侵犯肾盂，1例阳性的病理结果为腺性膀胱炎。见表1。

表1 新型尿脱落细胞学检查方法与TCT法诊断结果汇总

二、两种方法检测全部尿路上皮癌样本的敏感性、特异性、准确性对比

如表1所示，新型尿脱落细胞学检查方法检测尿路上皮癌的敏感性为64.9%(48/74)，明显高于TCT法的45.9%(34/74)，差异有统计学意义(χ2=5.360，P=0.021)。新型尿脱落细胞学检查方法检测尿路上皮癌的特异性为88.2%(15/17)，TCT法的特异性为82.4%(14/17)，差异无统计学意义(P=0.500)。新型尿脱落细胞学检查方法检测尿路上皮癌的准确性为69.2%(63/91)，比TCT法的准确性52.7%(48/91)更高，差异有统计学意义(χ2=5.196，P=0.023)。两种方法的受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线对比见图1。新型尿脱落细胞学检查方法的ROC曲线下面面积(area under curve, AUC)为0.866(95%CI：0.809～0.923，约登指数=0.668)；TCT法AUC为0.704(95%CI：0.625～0.783，约登指数=0.380)。

图1 新型尿脱落细胞学检查方法和TCT法ROC曲线对比图

三、两种方法检测不同类型和级别、性别、肿瘤位置尿路上皮癌的敏感性对比

如表2所示，在高级别尿路上皮癌样本中，新型尿脱落细胞学检查方法的检测敏感性高于TCT，差异有统计学意义(χ2=4.293，P=0.038)。在肌层浸润性尿路上皮癌样本中，新型尿脱落细胞学检查方法敏感性的检测高于TCT法，差异有统计学意义(χ2=10.057，P=0.002)。新型尿脱落细胞学检查方法在首发患者中的检测敏感性较TCT法高，差异有统计学意义(P=0.032)，在上尿路尿路上皮癌中的检测敏感性也较TCT法高，差异有统计学意义(P=0.020)。新型尿脱落细胞学检查方法在低级别尿路上皮癌和非肌层浸润性尿路上皮癌的检测中表现出的敏感性与TCT法相比差异无统计学意义。此外，两种方法在不同性别、复发患者和膀胱尿路上皮癌中检测敏感性差异均无统计学意义。

表2 新型尿脱落细胞学检查方法和TCT法对不同临床特征尿路上皮癌检测的比较[例(%)]

四、新型尿脱落细胞学检查方法对不同类型尿路上皮癌检测的比较

如表3所示，新型尿脱落细胞学检查方法对于高级别尿路上皮癌检测的敏感性明显高于低级别尿路上皮癌，差异有统计学意义(χ2=14.618，P<0.001)。新型尿脱落细胞学检查方法对于肌层浸润性尿路上皮癌检测的敏感性明显高于非肌层浸润性尿路上皮癌，差异有统计学意义(χ2=38.186，P<0.001)。新型尿脱落细胞学检查方法在女性和男性患者中的检测敏感性分别为65.0%和64.8%，差异无统计学意义(P=0.988)。新型尿脱落细胞学检查方法在首发患者中的检测敏感性较复发患者低，但差异无统计学意义(P=0.803)。新型尿脱落细胞学的检测方法在上尿路尿路上皮癌和膀胱尿路上皮癌中的敏感性分别是62.5%和60.0%，差异无统计学意义(P=0.206)。

表3 新型尿脱落细胞学检查方法对不同类型尿路上皮癌检测的比较

续表3 新型尿脱落细胞学检查方法对不同类型尿路上皮癌检测的比较

五、不同方法制作病理切片的质量比较

其中有3例尿液样本采用新型尿脱落细胞学检查方法和TCT法所制作切片图像如图2所示，新型尿脱落细胞学检查方法制作的病理切片较TCT法染色鲜艳，细胞数量多且集中，无重叠，细胞结构清晰，且与术后病理差距小。此外，TCT法只留下尿液中的脱落细胞，新型尿脱落细胞学检查方法切片中在保留尿液中脱落细胞的同时将脱落的组织部分做成病理切片，能进一步提高检出率。

A：新型尿脱落细胞学检查方法所制作切片(HE染色，×400)；B：TCT法制作切片(HE染色，×400)；C：术后病理切片(HE染色，×400)

六、两种检测方法的费用比较

TCT法的检查费用为180元/人次，新型尿脱落细胞学检查方法的检查费用为200元/人次。TCT法为成熟的检查方法，而新型尿脱落细胞学检查方法则在前期尿液预处理过程中仍有较大减少费用的空间。

讨 论

尿路上皮癌是泌尿外科最常见的恶性肿瘤，其中输尿管癌和肾盂癌占比不到10%[3]，部分临床病例的确诊仍有难度。非肌层浸润性膀胱癌约占全部膀胱癌的75%，5年生存率约88%～98%，而肌层浸润性膀胱癌的5年生存率只有46%～63%[4]，并且70%以上的膀胱癌患者经治疗后仍会复发[5]。膀胱癌的发病率和死亡率呈上升趋势[6]。学者们致力于寻找简便、经济、高效的检查方法，并对原有的方法进行改进。上世纪90年代液基细胞学制片技术的出现将脱落细胞检测带向新的高度，该方法制片质量高、检测阳性率令人满意，但实际操作也面临一些问题。有学者为提高对沉淀物稀少的尿液标本的检出率，尝试采用琼脂先行包埋尿脱落细胞再行组织病理学连续切片的方法用于对膀胱癌的诊断，获取的制片效果和检测阳性率较涂片法有优势[7]。在前人研究的基础上我们设计了一种尿脱落细胞学检查的新方法。

本研究中通过收集91例可疑尿路上皮癌患者的尿液样本，分别采用新型尿脱落细胞学检查方法和TCT法进行检测，并将检测结果汇总分析。结果发现新型尿脱落细胞学检查方法的敏感性为64.9%，特异性为88.2%，准确性为69.2%，新型尿脱落细胞学检查方法的敏感性较TCT法优势明显，特异性和准确性差异无统计学意义，原因可能为两者均是病理学检查方法，本身特异性高。新型尿脱落细胞学检查方法对于高级别尿路上皮癌的检测敏感性(77.8%)明显高于低级别尿路上皮癌(30.0%)，符合高级别尿路上皮癌分化程度低、易脱落的观点[8]。与TCT法比较，新型尿脱落细胞学检查方法在高级别尿路上皮癌诊断中敏感性有优势，在低级别尿路上皮癌诊断中则未体现出统计学差异，这可能是由于单独一个级别尿路上皮癌的样本量过低，难以得出有效结论。新型尿脱落细胞学检查方法对于肌层浸润性尿路上皮癌的检测敏感性(93.2%)明显高于非肌层浸润性尿路上皮癌(23.3%)，新型尿脱落细胞学检查方法较TCT法在肌层浸润性尿路上皮癌的诊断中表现出优势，在非肌层浸润性尿路上皮癌中差异则无统计学意义，可能是由于晚期尿路上皮癌细胞脱落较多，也更容易在尿液中被捕捉到。两种方法在不同性别、是否复发患者中的检测敏感性差异无统计学意义，在膀胱尿路上皮癌的检测中也未表现出统计学差异，可能是由于本研究样本量过低的原因。新型尿脱落细胞学检测方法制作的切片质量高，制片的同时还可以行免疫组化检查[9]，并且制作的切片能与患者术后的病理切片对照，进一步提高准确性。新型尿脱落细胞学检查方法在费用方面稍高于TCT法，但在前期尿液预处理过程中仍有减少费用的空间。

综上，新型尿脱落细胞学检查方法的优势主要有：①与传统尿脱落细胞学方法一样均为无创检查，患者接受程度高；②采集尿液量(250 ml以上)较传统方法多，且尿液采集量还可以增加，对于尿路上皮癌的检测敏感性较TCT法更高，尤其是对于高级别和肌层浸润性尿路上皮癌；③用晨起全部尿液代替第2次晨起中段尿，进一步减少脱落标本的丢失；④用醋酸溶液洗涤尿液去除红细胞、黏液、无机盐及杂质的过程可以重复，对于血尿严重、黏液多的标本较TCT法用滤网过滤的细胞或组织保存率高；⑤用琼脂和石蜡包埋的组织或细胞标本不易从玻片上脱落，较大限度地减少了标本损失；⑥所制作的切片质量高，细胞多且无重叠，视野清晰，与术后病理接近，保留脱落细胞的同时也能保留脱落的组织，后者在TCT法下被提前除去降低了其敏感性。

本研究中的问题与不足：①样本中细胞量较少时，在单独一种病理类型的尿路上皮癌检测中比较两种方法的差异无法得出说服力强的结论，如在非肌层浸润性尿路上皮癌和低级别尿路上皮癌中得出的结论；②增加尿液标本采集的量原理上能够进一步提高检出率，但尿液的新鲜程度和保存方式限制了采集量；③在细胞富集的流程中，需要特别注重操作以防止有形成分的丢失；④醋酸酸洗控制时间不宜过长，以防细胞形态变异，需迅速使用生理盐水冲洗以恢复细胞等渗状态；⑤本研究中出现了病理结果为肾源性腺瘤和黏液腺癌的2例样本，其中肾源性腺瘤在新型尿脱落细胞学检查方法和TCT检测中均表现为阳性结果，而黏液腺癌则均表现为阴性，对于尿路上皮癌之外的其他类型的肿瘤，新型尿脱落细胞学检查方法和TCT法是否能体现价值，目前还需要更多的研究来验证；⑥我们在研究中将新型尿脱落细胞学检查方法与TCT法比较时只比较了单次诊断效果，按照目前临床上均采用连续3次以上的TCT检查以提高检出率，新型尿脱落细胞学检查方法如果采用连续检测3次的方案，两种方法对于尿路上皮癌的检出率均会大大增加，如果以两种方法各3次的最终结果作为统计依据，新型尿脱落细胞学检查方法对于TCT法的敏感性优势可能并不能表现出明显统计学差异，后续仍需要进一步的研究来证实这一结论；⑦本研究中对于上尿路尿路上皮癌的样本未排除有输尿管肿瘤引起输尿管梗阻风险的患者，这使得两种方法的假阴性数量增加，最终敏感性趋于保守。

综上所述，在本研究中我们设计的新型方法保留了TCT法无创、高特异性、简便经济的特点，突破了细胞学对样本要求高的限制，对于带组织、血尿严重、黏液多、杂质多的样本均可以做到最大程度的保留样本，进一步提高检出率。新型尿脱落细胞学检查方法在不同级别、不同类型尿路上皮癌中检测的敏感性较TCT法表现出优势，在诊断高级别、肌层浸润性尿路上皮癌中的敏感性更明显，且与性别、复发与否、肿瘤位置无明显相关性。在保证无创性、简便经济的优势下，能进一步行免疫组化和术后病理对照，因此，新型尿脱落细胞学检查方法在尿路上皮癌诊断中有一定应用价值。