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脾虚痰湿证糖尿病前期模型的建立和评价

2022-11-23蔡嘉洛朱贻霖李晓屏易刚强夏新华邓桂明童巧珍黄莉

广州中医药大学学报 2022年11期
关键词:高脂造模脾虚

蔡嘉洛,朱贻霖,李晓屏,易刚强,夏新华,邓桂明,童巧珍,黄莉

(1.湖南中医药大学第一附属医院,湖南长沙 410000;2.湖南中医药大学,湖南长沙 410208)

糖尿病前期(pre-diabetes,PD)又称为糖调节受损,是指由血糖调节正常发展为糖调节受损,为血糖升高但尚未达到糖尿病诊断标准的状态[6.1 mmol/L≤空腹血糖(FPG)<7.0 mmol/L,或者7.8 mmol/L≤餐后2 h血糖(2hPG)<11.1 mmol/L],糖尿病前期可进一步发展成为2型糖尿病[1]。然而,糖尿病前期一般没有症状,不易被发现,多数患者在健康体检或因其他疾病检查时发现。但糖尿病前期是一个可逆的过程,对该人群进行早期干预,可使2型糖尿病发病危险降低58%[2-3]。

根据中医临床特征,糖尿病前期归属于中医的“脾瘅”病范畴。糖尿病前期发病多与禀赋不足、饮食不节、情绪失调、劳逸失度等因素相关[4-5]。经过长期临床经验总结,本课题组认为,糖尿病前期病机为外邪攻伐脾胃,致脾气亏虚,脾主运化功能失职,造成水湿内停,湿邪内生则发生本病,表现为脾虚痰湿证。建立并规范脾虚痰湿证糖尿病前期模型对于阐明该疾病机理具有重要的研究意义。本研究在以往动物模型的基础上进行改良,旨在探索一种更好地模拟临床糖尿病前期及符合中医脾虚痰湿证候特点的病证结合动物模型,模型表现有精神萎靡,朦胧欲睡,毛发枯槁,体味增加,粪便黏稠,呼吸喘急,检测指标总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)异常,谷丙转氨酶(ALT)正常,且6.1 mmol/L≤FPG<7.0 mmol/L,或者7.8 mmol/L≤2hPG<11.1 mmol/L。本实验采用60%高脂饲料喂养转基因BKS-db小鼠4周,同时结合强制游泳模拟疲劳因素建模,观察模型小鼠宏观表征和脾虚痰湿证指标,实验结果发现,单一因素造模实验组均不能完全符合预期目标,而高脂喂养结合疲劳干预组模型表现则可符合预期目标,现将具体研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 40只无特殊病原微生物(specific pathogen free,SPF)雄 性BKS-db小 鼠(BKSLeprem2Cd479/Nju基因敲除小鼠,通过敲除瘦素受体Lepr导致出现自发的血糖升高),购自江苏集萃药康生物科技公司,生产许可证号:SCXK(苏)20180008。动物实验单位为湖南中医药大学第一附属医院,动物使用许可证号:SYXK(湘)2020-0010。常规饲料适应性喂养4 d,60 W日光灯照射(07∶00-21∶00),室内温度(20±3)℃。本实验方案通过湖南中医药大学第一附属医院伦理委员会审批(批件号:HN-LL-SWST-2021-02)。

1.2 试剂与仪器 基础配方饲料,60%高脂配方饲料(60%脂肪、20%碳水化合物、20%蛋白质),购自江苏省协同医药生物工程有限公司。高速冷冻离心机(美国Thermo公司)。血液样本检测由湖南中医药大学第一附属医院检验科完成。

1.3 分组与造模 将40只BKS-db小鼠按照随机数字表分为4组,分别为空白对照组(对照组)、高脂饲料喂养组(高脂组)、强制游泳组(游泳组)、高脂饲料喂养+强制游泳组(多因素组),每组10只。对照组:给予基础配方饲料喂养4周。高脂组:给予60%高脂饲料喂养4周。游泳组:基础配方饲料喂养,每日将小鼠放入高20 cm、直径20 cm的圆柱形玻璃缸中,缸中水深10 cm,水温(25±1)℃,每缸1只,每日强制游泳15 min,随后取出放回笼中,持续4周。多因素组:给予60%高脂饲料喂养,同时每日强制游泳15 min,持续4周[6]。

1.4 观察指标与方法

1.4.1 小鼠一般情况观察 每周观察并记录各组小鼠的皮毛色泽、行为状态、体质量、呼吸状态、大小便等外观行为方面的变化。

1.4.2 生化检查 造模4周后,禁食不禁水12 h,采用生化分析仪检测小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT水平。

1.4.3 进食前后血糖测量 造模4周后,禁食不禁水12 h,通过尾尖采血的方式测量小鼠进食前后血糖的情况。具体操作方法:先将小鼠放置于单个操作笼中,将其固定并露出尾巴,用碘伏棉球擦拭消毒尾尖部,使用医用剪刀剪尾至出微量血液,用血糖试纸采血后等待读数,然后将小鼠尾尖碘伏消毒后放回原笼中。在测量完全部小鼠的FPG含量后,立刻给予葡萄糖灌胃,2、12、24 h后再次进行尾尖采血测量血糖值[6]。

1.4.4 脾虚痰湿证模型评估标准 脾虚证评估:根据脾虚表现分级量化标准(见表1),计算表中各项目得分之和即为脾虚积分,评价脾虚严重程度。总分≤6分,为无脾虚;7分≤总分≤12分,为轻度脾虚;13分≤总分≤18分,为脾虚;19分≤总分≤24分,为重度脾虚。

表1 脾虚分级量化评分标准Table 1 Quantitative grading criteria for spleen deficiency

痰湿证评估:观察各组小鼠形体、被毛、活动情况;采用生化分析仪检测TC、TG、HDL-C、LDL-C。若小鼠形体肥胖、被毛油腻、活动迟缓,血脂升高,则表明痰湿证造模成功[7-8]。

1.4.5 小鼠糖尿病前期诊断标准 当6.1 mmol/L≤FPG<7.0 mmo1/L或7.8 mmo1/L≤2hPG<11.1 mmol/L时,表明糖尿病前期模型造模成功[9]。

最后,根据脾虚痰湿证模型评估标准及糖尿病前期诊断标准,同时满足两者条件者即为脾虚痰湿证糖尿病前期模型。观测各组的成模率以及模型制备质量,从而对比出更佳的模型制备方法。

1.5 统计方法 应用GraphPad Prism 6.0软件进行统计处理。数据以均数±标准差(±s)表示,采用成组设计的两样本均数的t检验分析,或采用成组设计的两样本以上的多样本单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠体质量变化情况 图1结果显示,对照组小鼠体质量随着时间的推移稳步增长,高脂组和多因素组小鼠由于喂养高脂饲料的缘故,体质量迅速增长,形成肥胖。游泳组小鼠因给予劳倦过度法造模,在第20~25 d周体质量有所下降甚至减轻。

图1 各组小鼠体质量变化情况Figure 1 Changes in body mass of mice in each group

2.2 各组小鼠一般情况比较 对照组小鼠毛发光泽,活动度良好,粪便呈颗粒固体状。高脂组小鼠给予高脂饲料喂养后出现肥胖,毛发油腻。游泳组小鼠在后期出现毛发泛黄,体味发臭,呼吸急促,大便湿烂。多因素组小鼠毛发泛黄,光泽度下降,肛门附近经常残留大便且黏腻,活动减弱。造模4周后,多因素组和游泳组由于每日游泳过度疲劳导致各有1只动物死亡。

2.3 各组小鼠脾虚积分比较 表2结果显示:与对照组比较,游泳组、多因素组、高脂组造模4周后脾虚积分均升高(P<0.01)。由表2数据可知,对照组无脾虚症状,高脂组为轻度脾虚,而游泳组与多因素组小鼠均表现为典型脾虚。

表2 各组小鼠脾虚积分比较Table 2 Comparison of the spleen deficiency scores among various groups of mice (±s)

表2 各组小鼠脾虚积分比较Table 2 Comparison of the spleen deficiency scores among various groups of mice (±s)

①P<0.01,与对照组比较

组别对照组高脂组游泳组多因素组鼠数/只10 10 10 10脾虚积分/分5.1±1.8 16.2±2.1①18.8±2.0①9.2±1.7①

2.4 各组小鼠血脂水平比较 表3结果显示,与对照组比较,多因素组和高脂组的TC、TG、LDL-C值明显升高,HDL-C值及HDL-C/LDL-C比值明显降低(P<0.05或P<0.01)。游泳组各项血脂指标水平与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 各组小鼠血脂水平比较Table 3 Comparison of levels of blood lipids among various groups of mice (±s)

表3 各组小鼠血脂水平比较Table 3 Comparison of levels of blood lipids among various groups of mice (±s)

注:①P<0.05,②P<0.01,与对照组比较

组别对照组高脂组游泳组多因素组鼠数/只10 10 10 10 TC/(mmol·L-1)1.3±0.3 2.4±0.4①1.2±0.1 2.4±0.7①TG/(mmol·L-1)2.0±0.1 4.1±0.1①2.0±0.3 4.1±0.4①HDL-C/(mmol·L-1)2.1±0.3 0.6±0.3①2.3±0.3 0.6±0.1①LDL-C/(mmol·L-1)0.4±0.1 2.1±0.1②0.5±0.1 2.4±0.1②HDL-C/LDL-C比值5.25±0.3 0.25±0.3②4.6±0.3 0.25±0.1②

2.5 各组小鼠的ALT值比较 表4结果显示,与对照组比较,多因素组和游泳组的ALT值无显著差异(P>0.05),而高脂组ALT水平明显上升(P<0.01),表明高脂饲养单因素造模可引起小鼠肝功能的损伤。

表4 各组小鼠的谷丙转氨酶(ALT)值比较Table 4 Comparison of alanine transaminase(ALT)value among various groups of mice[±s,(IU·L-1)]

表4 各组小鼠的谷丙转氨酶(ALT)值比较Table 4 Comparison of alanine transaminase(ALT)value among various groups of mice[±s,(IU·L-1)]

注:①P<0.05,与对照组比较

组别对照组高脂组游泳组多因素组鼠数/只10 10 10 10 ALT 47.6±1.7 59.9±3.1①46.0±2.3 49.0±1.9

2.6 各组小鼠进食前后血糖值变化比较 造模4周后,对各组小鼠进食前,进食后2、12、24 h血糖进行测量。表5结果显示,各组血糖值均升高,6.1mmol/L≤FPG<7.0 mmol/L,或者7.8 mmol/L≤血糖值(进食后2、12、24 h)<11.1 mmol/L,差异无统计学意义(P>0.05)。

表5 各组小鼠进食前后血糖值变化比较Table 5 Comparison of blood glucose changes among various groups of mice before and after feeding[±s,(mmol·L-1)]

表5 各组小鼠进食前后血糖值变化比较Table 5 Comparison of blood glucose changes among various groups of mice before and after feeding[±s,(mmol·L-1)]

组别对照组高脂组游泳组多因素组鼠数/只10 10 10 10进食前6.12±0.3 6.67±0.3 6.88±0.4 6.78±0.3进食后2 h 7.22±1.49 7.87±1.21 7.69±1.11 7.92±1.39 12 h 7.93±0.83 8.31±0.21 7.93±0.29 8.98±1.65 24 h 7.77±0.21 8.01±0.56 7.77±0.18 8.43±0.34

3 讨论

糖尿病前期归属于中医“脾瘅”的范畴。脾瘅的发生,主要与湿、痰二邪有关。然痰湿之邪久滞,往往损及正气,如痰湿偏重,则损伤脾胃,造成湿邪困脾;痰湿久而化热耗损阴液,最终转化为消渴。因此,脾瘅也是消渴的发病原因。有效控制甚至逆转脾瘅可有效控制消渴的发生[10]。

调查显示,我国有大量患者处于糖尿病前期阶段,发病率呈现逐年上升的趋势,确诊人群以成人最为常见[3]。因糖尿病前期阶段以及肥胖型2型糖尿病无明显的临床症状,故这部分人群极易被忽略。糖尿病前期最主要表现为血糖升高但尚未达到糖尿病诊断标准的状态(6.1 mmol/L≤FPG<7.0 mmol/L,或者7.8 mmol/L≤2hPG<11.1 mmol/L)[1],同时,伴随与中医脾虚痰湿证相似的体征表现。因此,脾虚痰湿型糖尿病前期动物模型模拟临床糖尿病前期病例有较高的参考性[11-13]。

既往对脾虚痰湿证模型的研究多采用中医学病因结合西药药理方法复合因素造模,往往造成模型动物脏器不可逆转的损伤。中医学病因法包括耗气破气法、苦寒泻下法、饥饱失常法、过度劳累法等[14-16]。以往多使用大黄或者番泻叶等药物导泻[17-19]。但大黄或者番泻叶这些药物的毒副反应较大。本研究选用转基因BKS-db小鼠,模拟临床上糖尿病前期疾病,并采用高脂饲养联合强制游泳法的复合因素造模,以期可以更好地模拟临床脾虚痰湿证且能有效避免药物的毒副反应及对模型动物不可逆转的损伤。

在既往研究的动物模型[7]基础上,本研究对模型动物进行了改良,采用BSK-db小鼠造模。BSKdb小鼠的优点在于空腹血糖值和体质量可以始终维持在较高的水平,且与通过外部因素诱导胰岛素抵抗或者糖尿病前期小鼠模型相比,BSK-db小鼠由于其自发血糖异常的特点,无外界干扰诱导。同时,与目前最常用的糖尿病前期小鼠模型的建立方法——高脂饲料喂养联合小剂量腹腔注射STZ法比较,本研究模型所采用的BSK-db小鼠是因瘦素(leptin)受体基因缺陷导致的先天肥胖性2型糖尿病小鼠,其因瘦素受体基因失去功能,在出生后2周内即发生高胰岛素血症,3~4周发展为肥胖。而高脂饲料喂养联合小剂量腹腔注射STZ法构建糖尿病前期小鼠模型的机制是通过高脂饮食诱导小鼠产生胰岛素抵抗,通过注射STZ引起β细胞受损,其体型与正常小鼠体型无显著差异,少见肥胖现象。因此,虽然高脂饲料喂养联合小剂量腹腔注射STZ造模法与BSK-db小鼠高脂喂养结合疲劳法造模均在一定程度上模拟了临床糖尿病的症状,包括高血糖、高血脂、胰岛素抵抗等,但本研究采用BSK-db小鼠高脂喂养结合疲劳法造模,能较好地综合体现糖尿病前期脾虚痰湿证的各项生物体征及指标,更符合脾虚痰湿证糖尿病前期模型。

本研究结果显示,多因素组脾虚积分维持在18分,游泳组脾虚积分维持在16分,均较对照组明显升高,表明2组均出现明显脾虚症状。同时,多因素组与高脂组出现TC、TG、HDL-C、LDL-C指标异常,表明符合痰湿证模型特征,对照组和游泳组血脂水平未出现异常。饲养4周后,高脂组ALT较对照组明显升高,提示长期高脂喂养单因素可引起肝功能异常。各组小鼠均6.1 mmol/L≤FPG<7.0 mmol/L,或 者7.8 mmol/L≤2hPG<11.1 mmol/L,表明BSK-db小鼠是理想的自发性糖尿病前期动物模型。

综合以上指标,高脂饲料喂养联合强制游泳复合因素造模较高脂单因素,脾虚症状更加明显,且无ALT指标异常,较强制游泳单因素造模的小鼠血脂参数更符合痰湿证模型特征。总体来看,高脂饲料喂养合并强制游泳BSK-db小鼠表现为精神萎靡,朦胧欲睡,毛发枯槁,体味增加,粪便黏稠,呼吸喘急,TC、TG、HDL-C、LDL-C指标异常,而ALT指标无异常,符合脾虚痰湿证的体征,且6.1 mmol/L≤FPG<7.0 mmol/L,或者7.8mmol/L≤2hPG<11.1 mmol/L,因此可以作为脾虚痰湿证糖尿病前期模型的优选模型。

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