MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p在子宫内膜癌组织中的表达及其临床价值*

郭丽宁，常 蕊，杨 杰，许汴菊

榆林市第一医院妇产科，陕西榆林 719000

子宫内膜癌是常见的女性生殖系统恶性肿瘤，其发病率居女性恶性肿瘤第8位，死亡率仅次于卵巢癌和宫颈癌[1]。子宫内膜癌临床治疗主要以“早期发现、尽早治疗”为主，多采取以手术为主的临床综合治疗方法，但术后5年生存率仅维持在67%左右，术后复发、转移是影响患者预后的主要原因[2]。因此，从分子生物学角度深入探讨子宫内膜癌发生、发展及预后的敏感基因已成为临床研究重点。已有研究证实，黏蛋白4(MUC4)、CUE结构域蛋白2(CUEDC2)均具有癌基因特性，在多种恶性肿瘤中异常表达[3-4]。目前，关于子宫内膜癌组织MUC4、CUEDC2表达水平及其临床意义的报道较少。微小RNA(miRNA)是肿瘤领域研究热点，可能为恶性肿瘤早期诊断和预后评估提供新方向[5]。miR-193a-5p是目前学者关注的新焦点，关于其功能的报道还较少，初步研究发现，miR-193a-5p在前列腺癌、胰腺癌、子宫内膜癌等恶性肿瘤中低表达[6-7]。而miR-193a-5p对子宫内膜癌生物学行为的影响尚需进一步探讨。基于此，本研究探讨MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p在子宫内膜癌组织中的表达水平及其与病理特征、预后的关系，旨在为相关机制研究提供参考。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2014年5月至2016年5月在本院接受手术治疗的84例子宫内膜癌患者及84例子宫内膜息肉患者的病历资料进行回顾性研究。纳入标准：患者均经病理检查明确诊断，且术前未进行放、化疗或靶向等任何形式的治疗；子宫内膜癌组织及其匹配的癌旁组织、子宫内膜息肉组织标本、病历资料及随访资料完整。排除标准：远处转移患者；合并其他恶性肿瘤、急慢性炎症、血液性疾病患者；合并心、肝、肾等重要脏器严重病变患者；严重感染性疾病或免疫性疾病患者；妊娠期或哺乳期患者；随访过程中失访患者。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1资料收集 通过查阅电子病历获得患者临床病理特征信息，包括年龄、肿瘤最大径、肿瘤分化程度、组织类型、肌层浸润深度、FIGO分期、有无淋巴结转移等。

1.2.2MUC4、CUEDC2检测 采用免疫组织化学法进行检测。甲醛固定处理子宫内膜癌组织、癌旁组织及子宫内膜息肉组织标本，石蜡包埋，连续切片(4 μm)，脱蜡至水，高温抗原修复15 min，磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗3次(每次5 min)，二甲苯脱蜡，0.3%过氧化氢孵育10 min，灭活内源性过氧化物酶。再次PBS冲洗3次(每次5 min)，山羊血清封闭，室温下孵育30 min，分别滴加一抗鼠抗人MUC4抗体、CUEDC2抗体(均购自美国Abcam公司，MUC4抗体稀释比1∶800，CUEDC2抗体稀释比1∶300)，4 ℃过夜孵育，加入相应二抗，室温下孵育2 h。DAB显色3 min，苏木素复染，梯度脱水封片。细胞染色强度评分标准：不着色、颜色浅、颜色深分别为0分、1分、2分；阳性细胞评分标准：无着色细胞、阳性细胞数<25%、阳性细胞数25%～50%、阳性细胞数>50%分别为0分、1分、2分、3分。以细胞染色强度评分×阳性细胞评分为最终结果，0～2为阴性，3～6为阳性。

1.2.3miR-193a-5p检测 采用Trizol法提取子宫内膜癌组织、癌旁组织及子宫内膜息肉组织总RNA，反转录合成cDNA，后进行聚合酶链反应(PCR)扩增，扩增条件：95 ℃预变性5 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s，40个循环，以U6为内参。miR-193a-5p上游引物为5′-TGGGTCTTTGCGGGC-3′，下游引物为5′-GAATACCTCGGACCCTGC-3′；U6上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3′，下游引物为5′-AACGATTCACGAATTTGCGT-3′。结果采用2-ΔΔCt法进行分析。

1.2.4随访 对患者进行随访，随访时间5年，记录随访期间患者预后(死亡、生存)情况。

1.3观察指标 (1)记录子宫内膜癌组织、癌旁组织及子宫内膜息肉组织MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p表达情况。(2)比较不同病理特征子宫内膜癌组织MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p表达情况。(3)分析不同MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p表达情况子宫内膜癌患者的生存情况。(4)分析子宫内膜癌患者预后影响因素。

2 结 果

2.1子宫内膜癌组织、癌旁组织及子宫内膜息肉组织MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p表达情况 子宫内膜癌组织MUC4、CUEDC2阳性表达率高于癌旁组织、子宫内膜息肉组织，miR-193a-5p表达水平低于癌旁组织、子宫内膜息肉组织(P<0.05)；癌旁组织和子宫内膜息肉组织MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p的表达情况差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 子宫内膜癌组织、癌旁组织及子宫内膜息肉组织MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p表达情况

2.2不同病理特征子宫内膜癌组织MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p表达情况比较 不同年龄、肿瘤最大径、肿瘤分化程度、组织类型子宫内膜癌组织MUC4、CUEDC2阳性表达率及miR-193a-5p表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。与肌层浸润深度<1/2、FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移的子宫内膜癌组织比较，肌层浸润深度≥1/2、FIGO分期Ⅲ期、有淋巴结转移的子宫内膜癌组织MUC4、CUEDC2阳性表达率更高，miR-193a-5p表达水平更低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 癌组织MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p表达与病理特征的相关性

续表2 癌组织MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p表达与病理特征的相关性

2.3不同MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p表达情况子宫内膜癌患者5年预后情况比较 以子宫内膜癌组织miR-193a-5p表达水平均值为界，≥0.76为高表达，<0.76为低表达。子宫内膜癌组织MUC4、CUEDC2阳性患者5年生存率低于阴性患者(χ2=4.235、7.090，P=0.040、0.008)，miR-193a-5p低表达患者5年生存率低于高表达患者(χ2=4.495，P=0.034)。见表3、图1。

注：A、B、C分别为不同MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p表达情况子宫内膜癌患者的生存曲线。图1 子宫内膜癌患者生存曲线

表3 不同MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p表达情况子宫内膜癌患者5年预后情况比较[n(%)]

2.4子宫内膜癌患者预后影响因素的单因素分析 肌层浸润深度、FIGO分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移是子宫内膜癌患者预后的影响因素(P<0.05)。见表4。

表4 子宫内膜癌患者预后影响因素的单因素分析[n(%)]

续表4 子宫内膜癌患者预后影响因素的单因素分析[n(%)]

2.5子宫内膜癌患者预后影响因素的多因素分析 以子宫内膜癌患者术后5年生存情况为因变量，将表3、4中差异有统计学意义的项目为自变量建立Cox回归模型，具体赋值见表5。Cox回归模型分析结果显示，将肌层浸润深度、FIGO分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移控制后，阳性的MUC4、CUEDC2及低表达的miR-193a-5p是子宫内膜癌患者5年内死亡的独立危险因素(HR=3.582、4.171、0.390，P<0.05)。见表6。

表5 子宫内膜癌患者预后影响因素赋值表

表6 子宫内膜癌患者预后影响因素的Cox回归模型分析

3 讨 论

子宫内膜癌发病机制尚不清楚，目前普遍认为是多因素、多机制共同作用的结果，涉及多种癌基因、抑癌基因、核苷酸序列、转录因子等的改变[8]。目前，子宫内膜癌治疗还存在巨大挑战，尤其转移性及复发性子宫内膜癌患者[9]。因此，仍需深入研究子宫内膜癌发生、发展的分子机制，为患者临床诊治及预后改善提供理论依据。

黏蛋白(MUCs)是一种高相对分子质量的糖蛋白，在机体中广泛存在，具有细胞保护和润滑作用[10]。MUC4是跨膜型MUCs家族成员，位于人染色体3q29，由26个外显子组成，具有癌基因特性，参与恶性肿瘤发生和进展过程[11]。CUEDC2是一种含CUE结构域的蛋白质，参与细胞周期、炎症等多种生物学过程[12]。新近研究发现，CUEDC2在乳腺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤组织中高表达[13]。目前，关于MUC4、CUEDC2在子宫内膜癌中表达情况的研究较少，它们的作用机制尚未完全明确。本研究显示，子宫内膜癌组织MUC4阳性表达率高于癌旁组织(P<0.05)，且与肿瘤肌层浸润深度、FIGO分期、淋巴结转移有关(P<0.05)。MUC4参与子宫内膜癌发生、发展的可能机制：MUC4含3个类表皮细胞生长因子样结构域，均可结合ERBB3形成稳定异源二聚体，进而激活MAPK、JNK和STAT-1等信号通路，促进肿瘤增殖和转移；MUC4还能调节N-钙黏蛋白、E-钙黏蛋白信号通路，促进上皮向间质转化；此外，MUC4中大的寡糖侧链可形成空间障碍，抑制正常细胞与细胞、细胞与基质及配体与受体的相互作用[14-15]。同时，子宫内膜癌组织中CUEDC2也存在高表达(P<0.05)，且与病理特征有关(P<0.05)，考虑原因：CUEDC2表达水平升高可引起抑癌基因APC编码蛋白功能失活，导致染色体错聚和非整倍性，对肿瘤形成及进展起到促进作用，并促进p38磷酸化，激活丝裂原活化蛋白激酶途径，进而促进肿瘤细胞恶性增殖，还可通过激活应答细胞因子信号传导核因子κB，调控肿瘤进展[16-17]。本研究发现，癌组织MUC4、CUEDC2阳性表达的子宫内膜癌患者5年生存率降低(P<0.05)，且阳性的MUC4、CUEDC2是子宫内膜癌患者5年内死亡的独立危险因素(HR=3.582、4.171，P<0.05)。主要可能的原因是随MUC4、CUEDC2表达提升，子宫内膜癌恶性进展，淋巴结转移风险升高，患者生存情况往往更差。因此，临床针对上述影响因素采取针对性干预措施，有望最大程度改善患者预后。

基因的表达和结构改变是导致正常组织细胞恶性转化重要因素[18]。近年大量研究表明，非编码miRNA在调节恶性肿瘤基因表达中发挥重要作用[19-20]。miR-193a-5p是新近报道的与肿瘤密切相关的miRNA[21]。本研究发现，子宫内膜癌组织中miR-193a-5p表达下调(P<0.05)，且与患者肌层浸润深度、FIGO分期、淋巴结转移及预后不良相关(P<0.05)，表明miR-193a-5p参与子宫内膜癌的恶性进展。子宫内膜癌组织中阴阳因子-1(YY1)高表达，且在体内和体外均可促进癌细胞增殖和转移[22]。而miR-193a-5p可下调YY1表达，抑制癌细胞生长能力[23]。长链非编码RNA肿瘤易感候选者9(IncRNA CASC9)是子宫内膜癌相关lncRNA，可促进肿瘤增殖、侵袭和转移[24]。王婷婷等[25]采用StarBase v2.0在线软件预测发现IncRNACASC9与miR-193a-5p存在结合位点。推测miR-193a-5p可能是lncRNA CASC9的内源竞争RNA。因此，miR-193a-5p在子宫内膜癌中可能发挥抑癌作用。

综上所述，子宫内膜癌组织中MUC4、CUEDC2高表达，miR-193a-5p低表达，它们均与肿瘤肌层浸润深度、FIGO分期、淋巴结转移有关。特异性阻断MUC4、CUEDC2、miR-193a-5p的病理效应有望成为子宫内膜癌治疗的新方法，可能为靶向治疗药物开发提供依据。