膝骨关节炎实验动物模型现状研究进展

李书博，陈 赫，孙 云，魏敏章，宋坤玉，尹宏兵，崔镇海

（1. 长春中医药大学，长春 130117；2. 长春中医药大学附属第三临床医院，长春 130117）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种因过度劳损、外伤、不良体位、体质量过重等原因引起的慢性、退行性骨关节病，基本病理改变为关节软骨变性和丢失、滑膜增厚、韧带和关节囊病变以及关节边缘和软骨下骨质再生[1-4]，临床上主要表现为膝关节疼痛、肿胀、关节僵硬、活动受限甚至关节畸形等。虽然最新研究[5]提出应按照患者个人情况及症状、体征等采用具体的治疗方案，以提升个人生活质量。但实际上因为KOA的病因病机非常复杂，目前不能完全解释，早期的诊断尚不成熟，而常用的西药治疗绝大多数为非甾体抗炎药，长期服用会产生胃肠道出血、穿孔、甚至心血管疾病等不良反应，某些程度上阻碍了其临床应用[6-7]。所以现阶段中西医治疗仍以缓解症状、减缓病情发展为主。鉴于以上情况，以人为研究对象多有不便甚至违背伦理道德，因此通过创建简便可行的KOA动物模型，用以发掘KOA的发病机制、寻找合理有效的诊疗和预防方法成为研究 KOA的必经之路。

1 动物模型选择

科研人员在造模之前首先考虑的问题就是实验动物的选择。因为动物实验的最终目标是运用到临床，作用到人体，所以首先要考虑所选动物基因与人类基因是否相似。其次是生理结构、基础代谢、疾病特点是否与人类相似。最后是所选动物是否容易饲养、费用、伦理问题等。把上述问题归结到一起再进行综合选择。

1.1 小型动物模型

1.1.1 小鼠 小鼠基因组测序中蛋白质编码基因与人类相似度较高[8]，故可作为基因技术的常用模型，且适应能力较强，容易获取，费用较低。但不足之处是小鼠体型较小，在对膝关节进行操作时多有不便。

1.1.2 大鼠 大鼠膝关节软骨及滑膜的损伤与其他动物相比更迅速，病程变化较短，也常用于基因技术的造模，不足之处与小鼠一样，由于体型较小，膝关节也较小，对手术操作要求较高。

1.1.3 豚鼠 豚鼠与人类KOA组织病理学类似，且性格温顺，常常久坐不动，因为身体结构的原因，随着年龄逐渐增加，5月龄会逐渐形成自发性膝骨关节炎[9]。因此常用来作为自发性膝骨关节炎模型。

1.2 中、大型动物模型

1.2.1 兔 兔的体型与鼠类相比较大，膝关节除髌骨外，大体与人类似，且在形态学方面其关节软骨损伤后的修复亦与人软骨修复相似[10]，因此是手术操作及关节固定法等的理想模型。但由于兔的膝关节几乎总是处于屈曲形态，在生物力学上与人类不同，所以不适合功能性研究。

1.2.2 狗 狗的膝关节腔较大，更易于作为手术及操作的模型，且造模成功率比小型动物要高。另外，狗消化系统中的胃肠道与人类相似，因此可以作相应研究[11]。但是购买及饲养费用较高，术后抗感染能力较小型动物相比较低。

1.3 其他动物

如猪、马、羊、猕猴等，其关节腔更大，更容易手术操作，尤其是猕猴，这种动物与人类在形态、生理、病理等方面有很高的相似性，因而被用来研究各种与人类相关的疾病[12]。但考虑到费用昂贵，术后护理要求较高，且在伦理方面备受争议，因此在实验中运用较少。

2 造模方法分类

KOA造模方法一般分为以下2种：一种是自发性动物造模，指没有人类干预而自然产生；另一种是诱发性动物造模，指通过人为注射药物、手术诱导等产生。

2.1 自发性动物造模

2.1.1 天然自发性动物造模 天然自发性KOA模型，是指随着生长发育的进程，关节软骨自行退变、老化形成 KOA。目前，常用的实验动物主要有豚鼠[9]、STR/ort小鼠[13]等。陈松等[14]将3月龄豚鼠饲养2个月后建立自发性豚鼠KOA模型，通过病理切片发现造模后的5月龄豚鼠膝关节软骨下成骨细胞和成纤维样滑膜细胞发生明显改变。此造模方法受外界干扰因素少而且成功率比较高，在研究原发性KOA方面具备独特优势。缺点是自发过程所需周期较长，与其相对应的费用也较高，这也是实验中的弊端。

2.1.2 转基因动物造模 转基因KOA动物模型是应用基因技术把外源基因插入动物基因组中，并使之在动物体内表达，或者突变、敲除动物自身基因组中某些基因造成基因缺陷，从而导致软骨细胞发生异常变化[15]。现阶段常用的转基因动物模型是小鼠，其主要优点是易于进行遗传修饰[16]。于斐等[17]基因敲除小鼠沉默信息调节因子1（SIRT1），通过激活VEGF/AKT 通路加重骨关节炎关节软骨的退变，与手术横断前交叉韧带加内侧半月板切除法相比膝关节表面软骨毁损更严重，表面发生断裂，甚至出现软骨层缺失。转基因技术优点主要是避免手术创伤对实验带来的的影响，提高造模成功率，但是缺点也特别明显：目前此技术尚不成熟、造模成本较高、且不同动物基因亦不同。由于病毒载体存在潜在的致瘤性等问题及非病毒载体较低的软骨转染效率，限制了其应用于临床，因此转基因技术应用于人体还需要更多的临床前研究[18]。

2.2 诱发性动物造模

2.2.1 非手术造模

2.2.1.1 关节腔药物注射 关节腔内注射法是将药物注射进膝关节腔内诱导KOA的方法，所用药物有胶原酶、碘乙酸盐、尿激酶型纤溶酶原激活物、木瓜蛋白酶、菲律宾菌素等，其中木瓜蛋白酶、碘乙酸钠和胶原酶使用最为广泛。

木瓜蛋白酶可分解软骨基质中的蛋白多糖，使基质对软骨的保护能力降低，导致软骨细胞更易被破坏，同时软骨降解后碎屑进入滑液，刺激滑膜使其产生炎症，加快软骨破坏[19]。汤小康等[20]采用4%的木瓜蛋白酶对大鼠双膝关节腔进行注射。造模2周后将造模组与空白组大鼠对比发现前者双膝关节肿胀、行动不便，X线片可见非常显著的双膝关节面间隙狭窄，胫骨、股骨关节面磨损，关节边缘增生等异常表现。另外，模型的损伤程度与木瓜蛋白酶注射浓度呈正相关[21]，使用10%木瓜蛋白酶混合液6周即可制造出重度膝骨关节炎模型。注射木瓜蛋白酶优点是对模型创伤小，所需时间短，造模成功率高。缺点是不同模型所需浓度亦不同，因此剂量较难掌握。

碘乙酸钠（MIA）是目前OA关节腔注射最常用的化合物[22]，通过抑制Krebs循环的甘油醛-3-磷酸脱氢酶诱导软骨细胞凋亡，引起软骨基质改变、软骨降解丢失、滑膜炎症等病理改变。鲍哲明等[23]将8周龄雄性Wistar大鼠膝关节注射MIA 2周后发现，大鼠的膝关节软骨表面出现部分软骨缺失，软骨表面不规则，属于OA疾病中期的病理表现。而在造模 4 周后可见关节表面软骨大量缺损，软骨下骨质裸露，关节周围可见大量骨赘出现，属于晚期的 OA 程度。此方法操作简单、对操作者技术要求低，但碘乙酸钠属于毒性抑制剂，容易造成大量软骨细胞凋亡，容易对实验造成影响。

胶原蛋白酶作用的具体机制是其能水解关节腔内肌腱、韧带、半月板等组织中的胶原纤维，造成动物内侧膝关节脱位，引发膝关节不稳定[24]。Jeong等[25]将胶原蛋白酶注入大鼠关节腔进行造模，12 d后发现滑膜液中IL-6、TNF-α等细胞因子分泌明显增多，病理组织切片显示滑膜表面受到损伤，软骨蛋白聚糖减少，纤维组织排布散乱。相对于木瓜蛋白酶，胶原蛋白酶具有较高的特异性，故有药物用量少，方法简便、周期短等优势[10]。

关节注射法更加简单、便捷、高效，但此方法的缺点是药物剂量很难把握，相对误差较大等，容易给实验结果带来影响。例如大剂量、高浓度的木瓜蛋白酶进入血液循环中，会导致肺部溶血从而使实验动物死亡[26]。

2.2.1.2 关节固定法 是指将关节强制固定于一定体位，按照固定方式可分为屈曲位固定和伸直位固定。屈曲位固定原理是限制动物模型关节运动造成关节周围肌肉韧带及关节软骨萎缩，从而使关节软骨等组织发生萎缩性变化[27]。田育魁等[28]用改良屈曲位固定法将实验新西兰大白兔固定于屈曲位，造模8周后取膝关节部分组织，在光镜下看到胶原纤维不同程度增多且顺序比较混乱，关节软骨局部表面可见裂隙等。伸直位固定原理改变关节周围的应力而产生关节软骨退变[27]。何业文等[29]通过改良伸直位固定法对新西兰大白兔进行造模，在第2周和第6周分别解剖模型，并制成切片，经 HE 染色等方法观察结果后发现固定时间与关节炎严重程度呈正相关，且动物模型都出现不同程度的软骨细胞减少及软骨退变，且大大减少了造模时间。因为伸直位固定导致的KOA和临床上发病机制比较接近，故在实验中应用更为广泛[30]。综上所述，关节固定法是一种操作简单、实验过程可控、成功率高的造模方法，在保证造模效果的同时，避免了手术和药物对关节腔内结构的影响及破坏。不足之处关节固定法造模相关并发症较多，主要包括远端肢体血运障碍、动物一般情况差等[31]。

2.2.2 手术造模

2.2.2.1 传统 Hulth法及改良 Hulth法 Hulth法是目前常用建立KOA模型的实验方法之一。传统的Hulth手术造模方式为将模型手术麻醉后切断前交叉韧带、后交叉韧带及内侧副韧带，并切除内侧半月板[32]，即通过打破关节稳定性，使关节面直接摩擦从而形成KOA，传统的 Hulth法建模更接近于现在临床上中晚期的KOA。周丽等[33]运用此方法，4周后造模成功。此建模效果得到了广泛认可，但也存在一些问题，如手术创口较大、切除交叉韧带后膝关节极不稳定，易导致脱位，从而影响了实验的不确定性。因此，广大学者在传统Hulth手术建模方式的基础上进行了一些改良，李滔等[12]运用改良Hulth法手术造模，即将动物模型手术麻醉后切断膝关节内侧副韧带，切除前交叉韧带、内侧半月板，保留后交叉韧带，并在股骨内侧髁关节面切除部分软骨。6个月后看到关节软骨及滑膜等组织明显退变。与传统Hulth法比较，改良Hulth法对模型造成的手术创伤较小，成功率较高，数据可靠，是目前手术诱导KOA模型的经典方法。但是，对术者的操作、无菌技术及术后护理更加严格，此造模方法适用于早、中期膝骨关节炎研究。

2.2.2.2 前交叉韧带切断术（ACLT） 前交叉韧带切断术（ACLT）也是学者们现阶段建立KOA模型的常用方法之一，与Hulth法不同的是，ACLT是将实验动物麻醉后，在膝关节髌旁处取一切口，只将前交叉韧带进行切断，通过打破关节内稳定性来诱导软骨退变[34]。Tawonsawatruk 等[35]通过ACLT 对大鼠造模，分别于4周、8周、12周进行组织病理学评分，得出结论，造模组明显高于对照组；12周后HE染色显示造模组软骨细胞减少且分布不均。此方法具有操作简单、结构破坏小的优势，但不足之处是由于对膝关节应力破坏较小，导致诱导的模型病变进程较缓慢。

2.2.2.3 半月板部分或全部切除术（MMT） 半月板部分或全部切除术（MMT）即将实验动物麻醉后，切除部分或全部半月板，导致模型膝关节稳定性下降、加大关节面摩擦，从而加重磨损。Parrish 等[36]采用 MMT 对大鼠进行KOA 造模，且术后不限制活动，3周后组织病理染色结果显示模型关节软骨钙化，软骨下骨硬化及骨赘形成。此方法对动物模型造成的创伤小，与ACLT相比，造模时间短，结果稳定可靠，但仍对关节有创伤，适用于研究创伤性关节炎的病因病机，常与ACLT联用造模。

2.2.2.4 卵巢切除法 卵巢切除法是通过手术将雌性动物卵巢切除，降低雌激素水平，而骨量流失或者骨质疏松的大部分原因都是因为雌激素缺乏[37]，因此雌激素可能对膝骨关节炎的发展及病变具有抑制作用[38]。谭启钊等[39]将6只雌性 SD 大鼠在手术前 12 h 禁食，麻醉后减掉卵巢，术后每天注射抗生素连续注射 3 d，预防术后感染。8周后通过关节软骨组织切片发现软骨下骨微观结构的改变显著增高。此方法涉及的手术操作比较复杂，局限性较高，仅适用于雌性动物，且造模所需时间长。因此，仅适用于女性绝经、骨质疏松的相关研究。

3 讨论

动物模型的研究是进行临床KOA病因病机、治则治法、方药选择、日常保健等研究的重要基础。因此，在选择动物模型前，需要综合考虑各个模型的生理特性、经费预算、实验目的等再进行造模。造模方法多种多样，但各有利弊：1）自发性造模受到创伤、药物等其他因素干扰较少，但造模时间较长；2）基因技术成功率较高，但此技术尚不成熟，发展潜力巨大；3）药物注射操作相对简单，造模成功率相对较高，对模型造成的伤害较少，但药物剂量难以把控；4）手术造模时间短，成功率高，但对手术操作要求较高，术后护理要求也高等等。同时应紧跟学科前沿，随着时代的发展不断开创出新的动物模型和造模方法，最终应用于临床诊断与治疗。