骨质疏松症相关信号通路的研究进展

张 薇，熊斌彬，李冰枝，林海鸣

（福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122）

随着老龄人口日益增长，骨质疏松症对生活质量的影响愈发受到重视。作为骨代谢相关的常见慢性病之一，其发病机制还尚未完全阐明，该疾病还未被攻克［1］。研究表明，雌激素缺乏、衰老［1］、氧化应激［2］等都是引起骨质疏松的重要因素，近年相关通路也成为学者的研究热点。现对Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路、Hedgehog-Gli 通路、Notch 通路、骨形态发育蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）通路、沉默交配型信息调节因子2 同源蛋白 1（silent matingtype information regulation 2 homolog 1，SIRT1）通路的相关研究进展作一综述，为后续研究奠定基础。

1 Wnt/β-catenin 信号通路

Wnt 基因是一类由小鼠乳腺癌致病基因和果蝇无翅基因合并命名的分泌型糖蛋白［3］。Wnt/βcatenin 通路又称经典Wnt 信号通路，属于Wnt 通路中的一种。Wnt 信号通路可以调控细胞的生长、分化，对机体正常的生长、发育过程起到重要作用。近年来发现Wnt/β-catenin 通路与成骨细胞增殖分化密切关系，是治疗骨质疏松症的潜在靶点［4］。

该通路的机制是Wnt 蛋白先黏附到细胞膜表面，与膜蛋白受体复合物相结合，随后激活膜内的胞质内松散蛋白（dishevelled，Dsh），使其磷酸化，抑制胞内的四聚体活性，即腺瘤性结肠息肉病基因蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）、骨架蛋白、糖原合成酶激酶-3β、β-catenin，使其解体，从而使βcatenin 在胞质中含量增加并积聚，后移动到核内结合转录因子T 细胞因子（T cell transcription factor，TCF）/淋巴增强因子（lymphoid enhancer factor，LEF），形成基因转录复合体，最后在相关辅助因子作用下启动转录过程。但胞外Wnt 蛋白缺乏或膜蛋白受体被抑制时，复合物与β-catenin 结合成四聚体，导致磷酸化后 β-catenin 被降解［5］。

Wnt/β-catenin 通路主要通过影响骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）分化为成骨细胞的过程发挥作用。当BMSCs 数量不足时，则无法产生足量成骨细胞，使破骨细胞介导的骨吸收相对增加，导致骨质疏松症［6］。此前学者研究主要停留在蛋白水平，在已发现的19 种Wnt 蛋白中，Wnt1、Wnt7a、Wnt6、Wnt10a 和 Wnt10b 通过该通路推动BMSCs 成骨分化，后3 种还可以抑制其成脂分化［3，7-9］。并且由于各通路间的相互作用，Wnt10b 还可以通过增强BMP/Smad 通路的信号传导促进 BMP9 诱导 BMSCs 成骨分化［10］。因绝经后骨质疏松与雌激素水平下调密切相关，所以雌激素也是学者重点关注的因素之一。此前有研究表明雌激素能正向调节BMSCs 的成骨分化，而近年来薛青等［11］的研究再次证实了这个观点：通过上调Wnt3a 可以启动Wnt 通路，促进去势大鼠骨形成。在已知 Wnt 蛋白中，Wnt3a、Wnt4、Wnt5a 也参与破骨细胞的分化过程［12］。李芸等［13］以肺腺癌骨转移小鼠为研究对象，发现益肾固骨方可通过Wnt5a 减少小鼠股骨处破骨细胞表达。近年来逐渐有学者将目光投向了基因水平，Wnt 信号通路能促进BMSCs 分化，正调控 miRNAs 的产生［14］。有的基因通过上调该通路的表达起抑制骨质疏松的作用。为探讨 miR-141 在 Wnt/β-catenin 通路中的作用，LIU和GUO［15］分别使用了Wnt 通路激动剂和抑制剂进行实验，发现miR-141 高度表达能增加去势大鼠模型颌骨中的骨密度水平和骨形成相关标志物。miR-141 可通过激活Wnt 途径抑制去卵巢大鼠颌骨骨质疏松。孙新志等［16］研究发现长链非编码RNA Crnde通过调节Wnt 通路促进成骨细胞增殖，正调控骨形成。而有的基因表达则会抑制该信号通路，若此基因过表达将导致骨质疏松症状加剧；但是如果将该基因作为靶点，抑制其表达，则能起治疗作用。miR-409-5p 的表达抑制Wnt 通路，从而抑制成骨分化，故在去势小鼠中沉默miR-409-5p 表达可修复骨小梁微结构并抑制骨吸收［17］。ZHANG 等［18］将目的基因导入BMSCs后进行实验，结果表明下调miR-15a-5p 表达可通过 Wnt/β-catenin/PPARγ 信号通路抑制BMSCs 凋亡。因此针对miRNAs 进行靶向治疗或将成为骨质疏松治疗新思路。

2 Hedgehog-Gli 信号通路

Hedgehog（Hh）蛋白最早是由Christiane Nüsslein-Volhard 和Eric F.Wieschaus 在研究果蝇时作为一个“体节极性”基因发现的，该基因突变会导致果蝇胚胎呈多刺小球状，如同刺猬一般，故命名为Hedgehog［19］。有研究认为Hh 信号通路可以调控成骨细胞和破骨细胞的分化，与骨质疏松症的发生、发展有密切关系［20-21］。

该通路的机制是在没有Hedgehog 蛋白（Indian hedgehog/Ihh、Sonic hedgehog/Shh、Desert hedgehog/Dhh）的情况下，特异性受体Patched（Ptc）抑制Smoothened（Smo）的转移和活性，使下游靶基因转录受抑制；而当 Hedgehog 蛋白与 Ptc 结合，解除对 Smo 抑制时，Smo 与胞内信号分子结合形成复合物，使Gli 与蛋白激酶A 结合导入细胞核内，与目的基因启动子结合，激活转录［22］。

Hh 通路不仅可以通过调控成骨细胞介导的骨形成过程，还可以通过刺激破骨细胞的核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）表达促进增殖分化，从而调控骨吸收过程。宋斌等［23］分析研究数据后发现，沉默miR-152 的小鼠骨重建平衡相关指标BMP-2、Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨保护素（osteoprotegerin，OPG）表达量升高，RANKL 蛋白表达量降低，Hh 通路 Shh、Gli1蛋白表达量均升高，明显促进骨重建失衡恢复。邓洋洋等［24］用补肾活血中药干预去势大鼠，检测股骨与肾中Ihh 含量后得出Ihh 含量降低与骨质疏松有关的结论。高举会等［20］通过探究左归丸对骨质疏松作用发现：上调去势大鼠Smo、Gli1 可以激活Hh 通路，以达治疗骨质疏松的目的。梁学振等［25］研究结果显示，通过补肾活血胶囊含药血清干预可以诱导Hh 通路对BMSCs 成骨分化的正向调控，并抑制其成脂分化。Hh 通路一方面可通过刺激成骨细胞生长促进骨形成，另一方面又可刺激破骨细胞活性，促进骨吸收。Hh 通路表达和性别、年龄都有一定关系，LI 等［26］发现雌激素缺乏可以使去卵巢小鼠体内Hh 通路上调，诱导破骨细胞分化以促进骨吸收。MATSUMOTO 等［27］通过研究比较发现，Shh 可直接刺激老年小鼠破骨细胞形成，但是对于幼龄小鼠则刺激成骨细胞形成，并通过骨保护素间接抑制破骨细胞的形成。正是因为Hh 通路的双向调控作用，使其在骨代谢中具有重要作用。

3 Notch 通路

Notch 是一种跨膜受体兼转录因子，与细胞生长、分化密切相关，因此可以参与人体的多种功能，如与各种遗传疾病和癌症有关，与骨质疏松的发生、发展也密切相关［28］。

该通路的机制是Notch 的配体（Delta1、Delta3、Delta4 和 Jagged1、Jagged2）和受体（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4）相互作用。Notch受体分为胞外结构域、胞内结构域（Notch intracellular domain，NICD）和跨膜结构域。NICD 缺失会抑制Notch 靶基因的转录。Notch 未激活时，重组信号结合蛋白jκ（recombination signal binding protein jκ，RBPjκ）与转录抑制因子结合。Notch 经3 次酶切与配体结合活化后经γ-分泌酶复合体识别并释放NICD，NICD 在胞核内与DNA 结合蛋白结合为转录复合物，使其与转录抑制因子解离，启动转录因子，调控靶基因转录［29-30］。

Notch 信号通路对成骨细胞、破骨细胞和BMSCs 的功能调节均有重要影响。有部分学者认为Notch1 的激活可诱导 RANKL 抑制剂 OPG 表达，从而抑制骨吸收。还可以抑制硬化蛋白和Dkk1，增强 Wnt 信号，使成骨细胞分化，促进骨形成［31］。Notch1a 胞内区在成骨细胞中过表达甚至会导致骨质增生［32］。也有学者持相反观点，认为Notch 通路抑制成骨细胞分化：Notch1 激活时，通过抑制成骨细胞特异性转录因子（osterix，Osx）、Runx2 和 βcatenin 抑制成骨细胞生成［33］。王贵玲等［34］证明miR-34a-5p 通过抑制Notch1 通路促进成骨分化。研究表明Notch 激活不仅抑制成骨细胞分化，其持续激活还将一同抑制BMSCs 的成骨分化［35］。除此之外，多项实验结果提示Notch 通路对破骨细胞同样具有抑制作用，平依林等［36］通过体外病毒转染的方法使Notch1 蛋白高表达，刺激Notch 通路。该实验结果显示Notch1 的高表达对于RANKL 和巨噬细胞集落刺激因子诱导的破骨细胞的增殖分化过程产生了抑制效应。张涛等［37］研究证明高表达miR-187 对于调控Notch 通路作用于破骨细胞的强大作用，高表达该基因不但可以抑制破骨细胞增殖，同时还能诱导破骨细胞凋亡。王汝杰等［38］研究表明Notch 通路的配体Jagged1 可以抑制RAW 264.7 细胞的增殖，与何飞等［39］结果相一致。但也有相反的观点认为Notch2 的 NICD 与NF-κB 相关，诱导破骨细胞增加，促进了骨吸收。因存在不同的观点，所以还需要进一步深入研究，以阐明作用机制。

值得注意的是，Notch 通路与其他通路之间的联系尤为密切。王君等［40］分别刺激或抑制RANKL通路和Notch 通路中相关分子的表达，数据显示Notch1 对RANKL 有负调控作用，可以影响破骨细胞的分化及溶骨效应。COLOMBO 等［41］研究表明，Notch 的激活可以促进破骨细胞生成因子RANKL的分泌，Notch2 可以通过促进RANKL 信号的分泌刺激破骨细胞的分化。

4 BMP 通路

BMP 是TGF-β 超家族的一种组成成分，通过与存在于细胞表面的受体结合来执行不同的功能［42］。而 Smad 是 BMP 受体下游的转录调节因子，BMP 通过与其受体结合在骨骼生长和发育过程中发挥作用［43］。

该通路的机制是在调节骨代谢过程中，分为经典Smad 途径和非经典丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）途径。经典途径中，BMPs 先和细胞膜上的特异性受体结合，使BMPR-1 磷酸化后再与Smad 蛋白（主要为Smad1、Smad5、Smad8）结合，该复合物进入细胞核后激活Runx2、Osx 等转录因子，诱导BMSCs 向成骨细胞分化［44-45］。非经典途径中，BMP 通过激活 TAK1/2-MEK1/2-ERK1/2 通路，调节靶基因表达，影响成骨分化过程。这2 条通路之间可相互联系。

BMP 在介导骨形成过程中发挥重要作用［46］。BMPs 分为 4 个亚族，其中 BMP2、BMP6、BMP7 和BMP9 有骨愈合促进作用，而 BMP3、BMP13 则对骨生长起负性调节作用［47-48］。目前基于该通路利用传统中药对骨相关疾病治疗的研究不在少数。王皓等［49］发现骨化三醇胶囊可通过激活BMP-2/Smad/Runx2 通路，促进成骨分化。柴爽等［50］发现补肾健脾活血方可以通过调控BMP-2/Smad 通路的信号上调Runx2 表达以促进成骨细胞分化，还可以上调OPG 表达抑制破骨细胞分化。在基因层面，TANG等［51］表明在成骨分化过程中IncRNA-OG 的表达上调了 12 倍，且 IncRNA-OG 与 hnRNPK 在 BMSCs 的细胞核中可以形成复合物，证明IncRNA 促进成骨分化。还有其他研究证明miR-144 和miR-224 靶向 Smad 抑制 BMSCs 成骨分化［52-53］。

5 SIRT1 通路

SIRT1 是一种去乙酰化酶，与多条通路联系密切，间接作用于其他通路。SIRT1 主要在BMSCs 中表达，对BMSCs 的多向分化起调节作用。在骨重建过程中，SIRT1 促进BMSCs 成骨细胞分化，抑制破骨细胞分化。骨祖细胞中存在一种骨形成抑制因子——叉形头转录因子的O 亚型1（forkhead box O1，FOXO1），其作用机制为减弱Wnt 转导和骨祖细胞的增殖。而SIRT1 可以通过驱动FOXO1 和βcatenin 去乙酰化，促使Wnt 信号转导和成骨细胞生成［54］。 SIRT1 还 可 以 通 过 作 用 于 Runx2 通 路 和TGF-β 通路，促进 BMSCs 的成骨分化进程［55-56］。SIRT1 对相关转录因子也有调控作用，PPARγ2 是成脂分化的关键分子，会抑制BMSCs 向成骨细胞分化，它可以被SIRT1直接抑制，或通过运用PPARγ拮抗剂干预间接使成脂分化方向受阻，使SIRT1 推动BMSCs 向成骨细胞分化。同时还发现在基因分子水平研究中miR-146a-5p 直接靶向SIRT1 抑制成骨细胞活性。抑制miR-146a-5p 在骨形成中的表达有助于预防衰老和雌激素减退引起的骨丢失［57］。H2O2处理可以模拟成骨细胞的凋亡和氧化应激的增加，YAO等［54］基于对新生小鼠颅骨MC3T3-E1 细胞的H2O2处理发现：在SIRT1 过表达的成骨细胞中，ROS 水平升高的程度减少，说明SIRT1 适度过表达可以降低氧化应激来提高成骨细胞存活率，这与β-catenin 和FOXO1 途径的特异性靶基因表达有关。

6 小 结

除了上述目前研究较多的信号通路外，还存在如 RANKL 通路［58］、腺苷酸活化蛋白激酶［Adenosine 5'-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK］通路［59］、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）通路［47］、PI3K/Akt 通路［60］、MAPK 通路［61］等通路，都对于骨质疏松症的机制探究有意义。

综上所述，信号通路可以通过作用于BMSCs、成骨细胞或破骨细胞的增殖分化影响骨代谢，若其调节失衡则会产生骨质疏松的风险。目前学术界对于该病的信号通路研究大多还停留在单一信号通路，但近年来逐渐有学者意识到该疾病机制复杂，可能涉及多种通路相互作用。只有更深入交叉研究各通路间的关系才能彻底阐明骨质疏松的发生机制。目前已发现有传统中药作用于多条信号通路治疗骨质疏松的研究，梁倩欣等［62］借助网络药理学分析发现骨康方中药治疗骨质疏松起效与方剂中各君、臣、佐、使作用于通路有关，虽然每种中药有各自特有的靶点与通路，但都以MAPK 通路为枢纽联系，共同调控，以达到最佳疗效。黄胜男等［63］通过探究左归丸在骨质疏松治疗中的作用机制，发现其靶标网络也具有多靶点，借助多条交错复杂的不同通路作用于成骨和破骨过程，以达治疗目的。随着研究的深入，靶向的定位清晰，有望揭示骨质疏松症及其他骨代谢相关疾病的分子机制，为研制具有针对性的靶向药物提供理论依据。