雷公藤甲素通过调节沉默信息调节因子1/p53途径抑制肝癌HepG2细胞的增殖和迁移

周星言， 戴国瑶

1.连云港市第一人民医院药学部，江苏 连云港 222000；2.东部战区总医院药剂科

肝癌是临床常见的恶性肿瘤，手术及放化疗是其治疗的主要方式，然其术后复发率高，对临床常用化疗药物不敏感且存在一定的毒副作用，临床疗效不尽满意。因此，找寻低毒性、高效且对肿瘤细胞具有靶向作用的抗肿瘤药物及新的治疗靶点是当前研究的热点。雷公藤甲素是提取自雷公藤的一种天然二萜类活性成分，近年大量体内外研究证实，其能够抑制肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭，诱导细胞凋亡及自噬，逆转肿瘤细胞多药耐药，介导肿瘤免疫、抑制肿瘤血管生成，对人类多种肿瘤具有良好的抗肿瘤活性[1-2]。沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)是一种高度保守的烟酰腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖的去乙酰化酶，与多种重要转录因子及染色质或转录共调控因子相互作用，通过对组蛋白的去乙酰化作用在转录水平调控目的基因的转录表达，参与调节多种生物学行为[3-4]。研究证实，p53是SIRT1的非组蛋白作用底物，也是SIRT1的主要靶蛋白，SIRT1激活可使p53蛋白去乙酰化，降低p53稳定性及转录活性，诱导依赖于p53的促凋亡基因转录抑制，从而抑制细胞凋亡[5]，可见SIRT1/p53通路是调控细胞凋亡的重要途径之一。有研究表明，miR-204通过抑制SIRT1表达，可促进p53乙酰化，调控细胞生物学行为，增强阿霉素耐药敏感性[6]。SIRT1通过调控p53、叉头框蛋白O1(forkhead box O1，FoxO1)等重要的自噬组分诱导细胞自噬[7]。白藜芦醇通过DJ-1介导的SIRT1/p53通路可减轻心肌缺氧/复氧诱导的细胞凋亡[8]。基于目前有关雷公藤甲素与SIRT1/p53通路在肝癌中的作用机制研究报道极少，因此本研究拟探究雷公藤甲素对肝癌细胞增殖、迁移的作用及其与SIRT1/p53通路间的相关性，以期为肝癌的临床治疗提供更多的参考借鉴。

1 材料与方法

1.1 实验细胞及培养人肝癌细胞株HepG2购自中国科学院上海细胞库，用含质量浓度为100 g/L的胎牛血清、100 U/ml链霉素、100 U/ml青霉素的DMEM培养基，于37 ℃、体积分数为5%的CO2的孵育箱内培养。待细胞贴壁生长至90%时，用胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液进行细胞传代，用于实验。

1.2 药品、试剂及仪器雷公藤甲素(纯度≥98%)购自成都普思生物科技股份有限公司；Trizol试剂盒购自美国Invitrogen公司；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(CAS号：67-68-5)购自美国Sigma公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(CAS号：9002-07-7)购自美国Gibco公司；qRT-PCR试剂盒、反转录试剂盒购自南京凯基生物公司；Transwell 小室、细胞培养板购自Coming Costar公司；酶标仪购自美国Bio Tek公司；CCK-8试剂盒、RNA提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物公司；SIRT1、p53、乙酰化p53(acetylated p53, Ac-p53)及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体购自英国Abcam公司等。

1.3 实验方法

1.3.1 CCK-8法检测细胞增殖能力：取对数生长期HepG2细胞以6×103个/孔接种于96孔板，待细胞贴壁过夜后，根据预实验结果分别加入终浓度为50、100、200 nmol/ml的雷公藤甲素培养12、24、48 h，同时设置空白对照组(不做任何处理)，每组设6个复孔；作用结束后每孔加入10 μl的CCK-8溶液继续培养4 h，采用酶标仪于490 nm处检测各组吸光度值(A值)，实验重复3次，计算细胞增殖抑制率(%)=(A对照组-A实验组)/A对照组×100%。

1.3.2 Transwell实验检测细胞迁移能力：取对数生长期HepG2细胞胰酶消化，制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×105个/孔接种于6孔板，待细胞贴壁12 h后加药(同上)培养24 h，消化细胞，3 000 r/min离心5 min，制成单细胞悬液；将Transwell小室放入24孔板，上室加入单细胞悬液200 μl,下室加入含质量浓度为100 g/L的胎牛血清的完全培养基500 μl，培养箱培养12 h，用棉签擦拭多余细胞并擦干，4%多聚甲醛固定15 min，取出小室，质量浓度为50 g/L的结晶紫溶液进行染色，于镜下(放大200倍)随机选取5个视野观察、拍照，计数染色穿膜细胞数, 实验重复3次取平均值。

1.3.3 qRT-PCR检测SIRT1、p53 mRNA表达：取对数生长期HepG2细胞加药培养24 h后，采用Trizol法提取细胞总RNA，通过逆转录试剂盒反转录为cDNA，并以此为模板配置PCR反应体系，选取GAPDH为内参行qRT-PCR扩增反应；引物序列，SIRT1上游：5′-TACAGAGCGTGCAAGAGCTTG-3′，下游：5′-GCTTTGAT

AGTACGAAGGCG-3′；p53上游：5′-GGCCAGACAGCAA

GACAATGT-3′，下游：5′-TATGCCGCGAGCTACACTGAC-3′；GAPDH上游：5′-TTCGGTTATAGCGTTTGTT-3′，下游：5′-TCTGACGTTCACGCTTGC-3′。反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃退火5 s，60 ℃延伸10 s，共40个循环，采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA相对表达。

1.3.4 蛋白免疫印迹(Western blotting)检测通路相关蛋白表达：取对数生长期HepG2细胞以2×106个/孔接种于6孔板培养24 h，加药(同上)培养2 h，加入RIPA裂解液收集细胞，提取总蛋白，进行细胞蛋白样品定量、变性；取50 μg蛋白样品SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，BSA封闭1 h，洗膜，分别加入SIRT1、p53、Ac-p53一抗(稀释倍数1∶1 000)，4 ℃孵育过夜；PBS冲洗，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，继续孵育1 h，PBS洗膜，加入ECL发光液暗室成像，采用AlphaEaseFC 软件分析目标条带灰度值，以GAPDH作为内参。

2 结果

2.1 雷公藤甲素对HepG2细胞增殖的影响CCK-8法检测结果显示：随着雷公藤甲素浓度升高和作用时间延长，各作用组细胞增殖抑制率明显升高(P<0.05)，呈时间-剂量依赖性，其中200 nmol/ml雷公藤甲素作用48 h时细胞抑制率最明显(见图1)。

2.2 雷公藤甲素对HepG2细胞迁移的影响Transwell迁移实验检测显示，与空白对照组相比，随着雷公藤甲素作用浓度升高，各作用组细胞迁移数量剂量依赖性逐渐降低(P<0.05)(见图2)。

注：与12 h相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

注：与空白对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与50 nmol/ml组相比，#P<0.05；与100 nmol/ml组相比，&P<0.05。

2.3 雷公藤甲素对SIRT1、p53 mRNA及SIRT1/p53通路相关蛋白表达的影响qRT-PCR检测mRNA表达，结果显示：各作用组SIRT1表达较空白对照组剂量依赖性逐渐降低(P<0.05)；p53表达较空白对照组升高(P<0.05)，但各作用组组间差异无统计学意义(P>0.05)(见图3)。

注：与空白对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与50 nmol/ml组相比，#P<0.05；与100 nmol/ml组相比，&P<0.05。

Western blotting检测SIRT1、p53及Ac-p53蛋白表达，结果显示，与空白对照组相比，各作用组SIRT1蛋白表达剂量依赖性逐渐降低，Ac-p53蛋白表达剂量依赖性逐渐升高(P<0.05)；各作用组p53蛋白表达均较空白对照组升高(P<0.05)，但组间差异无统计学意义(P>0.05)(见图4)。

3 讨论

近年来，随着对抗肿瘤药物的不断研究发现，中药具有多靶点、多通路、多途径、交叉发挥作用等特点，能够作用于肿瘤发生、进展的多个环节，表现出独特的抗肿瘤优势，受到医学研究者的广泛关注[9]。因此，找寻具有抗肿瘤作用的中药不失为肿瘤研究的一种新途径。雷公藤甲素是从雷公藤中提取的活性最高的成分之一，具有抗炎、抗生素、免疫调节等药理活性[10]。随着分子生物学技术及现代免疫学的进步，雷公藤甲素的抗肿瘤活性被逐渐报道，指出其主要通过阻滞细胞周期、促进细胞凋亡、抑制肿瘤新生血管形成等在人类

注：与空白对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与50 nmol/ml组相比，#P<0.05；与100 nmol/ml组相比，&P<0.05。

多种恶性肿瘤中发挥抗肿瘤作用[2]。近期研究证实，雷公藤甲素可抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖，诱导细胞凋亡[11]；通过影响细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)的磷酸化，显著抑制肺癌A549细胞活力，诱导细胞发生自噬[12]；通过抑制P13K/AKT通路信号转导，诱导结肠癌细胞自噬[13]；通过降低HCA66表达，干扰核糖体18S RNA合成，诱导非小细胞肺癌细胞凋亡和周期阻滞[14]。并证实，雷公藤甲素通过周期素依赖性激酶7/RNA聚合酶Ⅱ大亚基(cyclin dependent kinase 7/largest subunit of RNA polymerase Ⅱ, CDK7/RPB1)诱导多药耐药肿瘤细胞杀伤[15]；雷公藤甲素通过激活肿瘤抑制基因p53抑制肝癌细胞活力，诱导细胞凋亡[16]；雷公藤甲素可诱导肺腺癌紫杉醇耐药细胞株A549/Taxol凋亡，抑制凋亡相关基因表达，通过抑制RNA聚合酶Ⅱ的功能及NF-κB信号通路抑制广谱耐药基因转录，发挥耐药逆转作用[17]。以上研究提示，雷公藤甲素除发挥显著的抗肿瘤作用外还可逆转细胞多药耐药。本研究经采用不同终浓度雷公藤甲素处理HepG2细胞，探究其对肝癌细胞增殖、迁移的作用，发现HepG2细胞增殖抑制率明显升高，呈时间-剂量依赖性，且显著抑制了HepG2细胞迁移能力，提示雷公藤甲素有良好的抗肿瘤作用。

目前，已证实雷公藤甲素的抗肿瘤作用，但对其发挥作用的相关信号通路的研究报道各不相同。SIRT1/p53通路是调控细胞凋亡的重要途径，SIRT1是组蛋白脱乙酰酶家族的成员，具有去乙酰化酶的作用，能够调节p53、E2F转录因子1(E2F transcription factor 1，E2F1)、FOXO、NF-κB等非组蛋白产生去乙酰化，参与调控肿瘤发生发展进程[18]。p53是细胞重要的转录因子及抑癌因子，研究证实，p53基因是SIRT1去乙酰化非组蛋白靶点，SIRT1激活可通过去乙酰化修饰p53蛋白，调控抑制p53基因表达，从而抑制p53蛋白介导的细胞凋亡[19]。并证实，约90%的AC-p53可被SIRT1去乙酰化[5]。AC-p53作为p53的活化形式，可诱导不同位点基因表达，使细胞周期阻滞，促进细胞凋亡[5]。而基于SIRT1/p53信号通路，近年研究表明，miR-204通过靶向调控SIRT1/p53信号通路抑制霍奇金淋巴瘤细胞增殖[20]。雌二醇通过激活SIRT1/p53通路对人晶状体上皮细胞发挥抗凋亡作用[21]。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)通过抑制SIRT1的酶活性，上调p53乙酰化水平，调控SIRT1/p53信号通路抑制卵巢癌SKOV-3细胞活力并诱导细胞凋亡[22]。半乳糖醇通过调控SIRT1/p53通路抑制肝细胞癌的增殖和迁移[23]。miR-34a通过调控SIRT1/p53通路能够抑制人SW480细胞的迁移和侵袭[24]。此外，最新研究表明，SIRT1参与调节包括肝癌在内的多种恶性肿瘤的发生发展过程，肝细胞癌中SIRT1的去乙酰化酶活性是其致癌的关键[25]。肝癌患者大多存在p53的异常或突变，肝癌组织及细胞中SIRT1异常高表达，与临床病理及预后关系密切，提示SIRT1、p53是肝癌治疗研究的新型靶点。基于此，本研究探究了雷公藤甲素是否通过调控SIRT1/p53信号通路进一步发挥抗肿瘤作用。研究初步验证发现，相比空白对照组，各浓度作用组SIRT1 mRNA及蛋白表达剂量依赖性逐渐降低，Ac-p53蛋白表达剂量依赖性逐渐升高；p53 mRNA及蛋白表达较空白对照组明显升高，但各浓度作用组间差异无统计学意义。提示雷公藤甲素预处理可以抑制SIRT1表达，促进p53表达及乙酰化，可能通过调控SIRT1/p53信号通路进而抑制肝癌细胞的增殖及迁移。

综上所述，雷公藤甲素能够抑制肝癌细胞的增殖及迁移，其可能通过降低SIRT1表达，上调Ac-p53表达，进而调控SIRT1/p53信号通路发挥抗肿瘤作用。