正交试验优化二味参苏饮的提取工艺

赵冰洁，张 渊，王澳华，王 番，李红玉，李悦宁，4，肖柯心，郭东艳，贾艳艳*

（1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.西京医院，陕西 西安 710032；3.西安医学院，陕西 西安 710021；4.西北大学，陕西 西安 710000）

古方参苏饮始载于《妇科大全良方》，由人参、苏木二味中药组成，具有解表化痰、益气宽胸的功效，临床适用于因肺气不能宣畅所导致的咳嗽痰多，胸闷鼻塞，倦怠乏力，气短懒言。为进一步开发古方，本课题拟优化二味参苏饮的提取工艺，以出膏率、巴西苏木素含量和水浸出物作为评价指标，以加水量、浸泡时间、提取次数和提取时间为考察因素，选取单因素试验和正交设计优化该处方的提取工艺。

1 实验材料

1.1 药品与试剂 人参、苏木饮片购自西安灏洋生物技术有限公司，经鉴定符合《中华人民共和国药典》2020版一部的要求；巴西苏木素对照品（大连美仑生物技术有限公司）；人参皂苷Rg1对照品（阿拉丁试剂有限公司）；甲醇（Fisher Chemical）；乙腈（Fisher Chemical）；正丁醇（富宇试剂）。

1.2 仪器DGU-20A高效液相色谱仪（日本岛津）；DHG-9030A电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；HH-2数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；N-1300旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；KQ5200DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SHB-3循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；BSA224S分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；JEA102电子天平（上海蒲春计量仪器有限公司）。

2 方法和结果

2.1 浸泡时间的单因素考察 根据二味参苏饮的中药比例关系，取人参30 g、苏木60 g，总药材量为90 g，分为10份，即每份含人参3 g、苏木6 g。每份加10倍量（90 ml）的水，将药材浸泡时间设置梯度，在10～100 min之间每10 min取1份药材，滤过，计算不同时间内药材的吸水量和吸水率。结果见图1。

图1 浸泡时间与吸水量结果

从图1中可以看出，二味参苏饮中人参和苏木两味药材的吸水量随浸泡时间的增加呈现上升的趋势，直到浸泡80 min后吸水量不再上升，此时药材达到了吸水饱和的状态。因此，将二味参苏饮的浸泡时间定为80 min。

2.2 提取工艺的优化 采用正交试验，经单因素试验确定浸泡时间后，以加水量（A）、提取次数（B）和提取时间（C）为考察因素，以出膏率、水浸出物、巴西苏木素含量作为评价指标，运用L9（34）设计筛选二味参苏饮的提取工艺。考察因素和水平见表1。

表1 因素水平表

2.3 巴西苏木素含量的测定

2.3.1 色谱条件DGU-20A高效液相色谱仪（日本岛津）；流动相为甲醇∶水（90∶10，V/V）；流速0.8 ml/min；柱温35℃；进样量20 μl；波长285 nm。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取巴西苏木素对照品10.00 mg，加甲醇制成每1 ml含400 μg的对照品溶液母液。

2.3.3 供试品溶液的制备 精密称取人参10 g、苏木20 g，加入适量水浸泡80 min，按表3的正交试验方案进行提取，浓缩至80 ml，蒸发皿中蒸干水分，烘箱干燥至恒重，密封保存，即得样品。将所制备的9组样品分别精密称取10.00 mg，置于25 ml容量瓶中，用色谱级甲醇定容，摇匀，溶液过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即为供试品溶液。

精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20 μl，按2.3.1项色谱条件进样测定，记录色谱图，见图2。

图2 HPLC色谱图

2.3.4 线性关系考察 精密吸取1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml、10 ml巴西苏木素对照品溶液母液置于10 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，稀释成浓度为40 mg/ml、80 mg/ml、120 mg/ml、160 mg/ml、200 mg/ml、400 mg/ml的溶液。溶液过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，分别进样20 μl，按照2.3.1项色谱条件测定，以对照品浓度（μg/ml）为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程：Y=33 562X+54 848，r2=0.999 9。结果表明，巴西苏木素对照品在40～400 μg/ml范围内线性关系良好。

2.3.5 精密度试验 取巴西苏木素对照品溶液连续进样6次，每次20 μl，测定巴西苏木素峰面积积分值，RSD为0.24%（n=6），表明本法测定精密度良好。

2.3.6 稳定性实验 取同一份供试品溶液，按2.3.1项下色谱条件，分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样测定，结果巴西苏木素峰面积积分值RSD为0.64%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.7 重复性试验 取同一供试品溶液2份，各20 μl，分别按2.3.1项下色谱条件进样测定，结果巴西苏木素的平均含量为0.056 1 mg/ml，RSD为1.90%（n=2）。

2.3.8 加样回收试验 取已知含量的二味参苏饮供试品溶液（巴西苏木素平均含量为0.056 1 mg/ml），共取9份，每份25 ml，分别加入对照品溶液（0.400 0 mg/ml）1 ml、2 ml、3 ml各3份，按2.3.3项下方法制备供试品溶液，按2.3.1项下色谱条件进样测定峰面积积分值。结果巴西苏木素平均回收率为92.68%，RSD为2.16%（n=9），见表2。

表2 巴西苏木素加样回收试验结果 （n=9）

2.3.9 含量测定 取9份供试品溶液，按2.3.1项色谱条件进样，测定样品中巴西苏木素的含量，结果见表3。

2.4 出膏率的测定 取按2.3.3项方法制备得的9份样品，分别置于蒸发皿中蒸干，蒸干后置于烘箱中干燥至恒重，最后将其置于干燥器干燥30 min后迅速称重，计算出膏率，结果见表3。

2.5 水浸出物的测定 按照《中华人民共和国药典》水溶性浸出物测定法测定水浸出物的含量。分别取按2.3.3项方法制备得的9份样品各3.5 g，精密称定，置于150 ml锥形瓶中，精密加水100 ml，密塞，称定重量，静置1 h后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1 h，放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用水补足减少的重量，水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h，置于干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量，以干燥品计算供试品中水浸出物的重量，结果见表3。

2.6 正交试验方案及结果 正交试验结果见表3，方差分析见表4～表6。

表3 二味参苏饮提取工艺正交设计方案及结果

表4 出膏率方差分析

表6 巴西苏木素含量方差分析

表5 水浸出物含量方差分析

从表4～表6得出，以出膏率为评价指标时，C因素差异具有统计学意义，其重要性依据顺序为C＞A＞B；以水浸出物含量为评价指标时，A、B、C三个因素均无显著影响；以巴西苏木素含量为评价指标时，A、B、C三个因素也均无显著影响。

再直观分析表3，出膏率的极差（R值）C＞A＞B，表明：各因素对提取效果的影响为提取时间＞加水量＞提取次数，最佳参数为A3B3C3，即加12倍水量回流提取120 min，10倍水量回流提取90 min，8倍水量回流提取60 min，共3次，将3次提取液合并，供下一步使用。

3 讨 论

二味参苏饮由人参和苏木两味药材组成，人参敛气补气［1］，苏木活血祛瘀［2］。《医宗金鉴》喘咳篇曰“损伤之证喘咳者，若因出血过多，面黑胸胀，胸膈痛而发喘者，乃气血乘于肺也，急用二味参苏饮，缓则难救”，《妇人大全良方》记载二味参苏饮主治“妇人产后血入于肺，面黑发喘欲死者”［3］。水提法不仅符合该方的传统用药理念，而且与该方中人参和苏木的理化性质相符合，有利于发挥药效。

苏木的主要药效成分巴西苏木素在肾脏组织分布浓度最高，可抑制NF-κB信号通路调控炎性因子的表达进而发挥肾保护作用［4］。本研究前处理方法参考药典中巴西苏木素的前处理方法［5］，通过对巴西苏木素含量以及出膏率、水浸出物含量指标进行综合评价，采用L9（3）4正交试验优化二味参苏饮的提取工艺，从而得到最优的提取方案，即加入12倍水量回流提取120 min，10倍水量回流提取90 min，8倍水量回流提取60 min，共3次。本试验确定了二味参苏饮的最佳提取方案，可为二味参苏饮的现代应用提供参考。