附芍祛黄颗粒的含量测定及其双酯型生物碱的限量研究

秦超燕，蓝艳梅，李飞燕，王明刚

（广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023）

附芍祛黄颗粒是广西中医药大学第一附属医院肝病科毛德文教授治疗慢性肝衰竭的经验方，全方由附子、赤芍、人参、大黄等中药组成。为方便患者携带和保存，本院制剂室将原汤剂改为颗粒剂。本研究采用高效液相色谱法（HPLC）对附芍祛黄颗粒中赤芍所含的芍药苷进行含量检测，并对附子中存在的双酯型生物碱进行限量检测，旨在保障该药物在临床使用的安全性和有效性。

1 实验材料

1.1 仪器Agilent1260高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；SDFY-200A型高速万能粉碎机（上海乔跃实验设备有限公司）；Mettler XSR205十万分之一分析天平（梅特勒-托利多集团）；UPC-11-10T优普系列超纯水仪（四川优普超纯科技有限公司）。

1.2 试药 芍药苷（批号：120917-201712）和乌头双酯型生物碱对照提取物（批号：112029-201601）均购自中国食品药品检定研究院；附芍祛黄颗粒（批号：20191212、20191214、20191217），由广西中医药大学第一附属医院制剂室提供；乙腈（美国Fisher公司）和四氢呋喃均为色谱纯；甲醇、乙醇和磷酸等试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 芍药苷的含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的芍药苷对照品8.24 mg，置25 ml容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，制成0.329 6 mg/ml的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取附芍祛黄颗粒1.0 g，加入70%乙醇25 ml，称定重量，超声30 min，放冷，再称定重量，补足减失的重量，滤过，离心，取续滤液，即得。

2.1.3 色谱条件 色谱柱为Thermo C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇-0.1%磷酸水溶液为流动相，采取梯度洗脱方式洗脱，洗脱条件见表1；检测波长230 nm，柱温30℃，流速1.0 ml/min，进样量10 μl。在此色谱条件下，芍药苷与相邻峰分离良好，结果见图1、图2。

表1 芍药苷梯度洗脱条件

图1 芍药苷对照品色谱图

图2 附芍祛黄颗粒样品色谱图

2.1.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液1 μl、3 μl、5 μl、7 μl、10 μl、15 μl，注入液相色谱仪，按2.1.3项下的色谱条件检测，以对照品进样量（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，作线性回归，得回归方程为：Y=3.0×106X+869 673（r2=0.999 8）。结果表明，芍药苷的线性范围为0.329 6～4.944 μg，线性关系良好。见图3。

图3 对照品线性关系图

2.1.5 精密度试验 精密吸取上述2.1.1项下的对照品溶液，连续进样6次，按2.1.3项下的色谱条件进行测定，记录并计算赤芍药材中芍药苷的峰面积，结果RSD为0.47%（n=6），结果表明该方法精密度较好。

2.1.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h依法测定附芍祛黄颗粒中的芍药苷的峰面积，结果显示附芍祛黄颗粒中的芍药苷峰面积的RSD值为1.36%（n=6）。其RSD值均小于3.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 精密称取附芍祛黄颗粒（批号：20191212）样品6份，按2.1.2项供试品溶液制备方法制备样品溶液，再按照2.1.3项色谱条件测定样品成分的峰面积，依据峰面积计算附芍祛黄颗粒中芍药苷的平均含量，结果测得附芍祛黄颗粒中芍药苷的平均含量为2.992 1 mg/g，RSD值为2.11%（n=6）。其RSD值均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密量取已知含量的附芍祛黄颗粒（批号：20191212，芍药苷含量为2.992 1 mg/g）约0.5 g，共6份，加入芍药苷对照品，按2.1.2项下方法制备样品溶液，再按2.1.3项色谱条件进样测定，计算附芍祛黄颗粒中芍药苷的平均回收率和RSD值。结果见表2。

表2 加样回收率试验结果 （n=6）

编号 3 4 5 6称取样品量（g）0.501 1 0.501 5 0.500 4 0.500 3样品含量（mg）1.499 3 1.500 5 1.497 2 1.496 9加入量（mg）1.51 1.51 1.51 1.51测得量（mg）2.958 8 3.046 7 2.999 1 2.955 9回收率（%）96.65 102.39 99.46 96.62平均回收率（%）99.53 RSD（%）2.51

2.1.9 样品含量测定 取本品3批次附芍祛黄颗粒约1.0 g，精密称定，同上述2.1.2项的方法制备供试品溶液，精密量取10 μl注入高效液相色谱仪，以外标法计算附芍祛黄颗粒中芍药苷的含量，结果见表3。

表3 附芍祛黄颗粒样品含量测定结果 （n=3）

2.2 双酯型生物碱的限量检测［1-4］

2.2.1 色谱条件 色谱柱为Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A：乙腈-四氢呋喃（25∶15），流动相B：0.1 mol/L醋酸铵溶液，采取梯度洗脱程序（见表4）；柱温30℃，检测波长235 nm，流速1.0 ml/min，进样量10 μl。

表4 双酯型生物碱梯度洗脱程序

2.2.2 对照品溶液的制备 取适量的乌头双酯型生物碱对照品提取物（新乌头碱、次乌头碱、乌头碱混合对照品），加入异丙醇与二氯甲烷（1∶1）配置成的混合溶液，制备成含新乌头碱7.925 μg/ml、次乌头碱7.5 μg/ml、乌 头 碱7.95 μg/ml的 混 合 对 照 品 溶 液。见图4。

2.2.3 供试品溶液的制备 取附芍祛黄颗粒约2 g，用氨试液3 ml、异丙醇25 ml与乙酸乙酯25 ml的混合溶液混匀，超声处理30 min，冷却后精密称定重量，用上述混合溶液补足减失的重量，过滤，取续滤液25 ml，低温（35℃）减压回收，干燥至恒重，用异丙醇1 ml与二氯甲烷1 ml的混合溶液溶解残渣，离心取上清液，即得。

2.2.4 标准曲线的制备 取2.2.2项下的混合对照品溶液，照2.2.1项下色谱条件分别进样10 μl、12 μl、14 μl、16 μl、18 μl、20 μl测定，以对照品的含量为横坐标，峰面积为纵坐标做线性回归方程，结果见表5、图5、图6。

表5 线性关系考察结果

图5 新乌头碱标准曲线

图6 次乌头碱标准曲线

2.2.5 含量测定 取20201212、20201214、20201217批次供试品，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，再按2.2.1项下色谱条件进样，测定附芍祛黄颗粒中双酯型生物碱的含量。结果附芍祛黄颗粒中检测不到乌头碱的存在，新乌头碱和次乌头碱总量为0.006 4%。色谱图见图7。结果见表6。

表6 附芍祛黄颗粒中双酯型生物碱限量检测结果 （n=3）

图7 附芍祛黄颗粒中双酯型生物碱色谱图

3 讨 论

3.1 HPLC测定条件的选择 在芍药苷含量测定的试验中，曾对流动相（甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.3%磷酸溶液、甲醇-水、乙腈-水）和柱温（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）进行了考察。研究发现，最终确定的流动相和柱温条件对芍药苷分离度好，峰形稳定，保留时间适合，没有阴性干扰和拖尾现象。此外，还考察了不同流速（0.8 ml/min、1 ml/min、1.2 ml/min），结果显示流速1 ml/min效果较好。

3.2 双酯型生物碱的限量检测 附子含有毒性较大的双酯型生物碱，对心脏毒性较大，所以多用其炮制品。本实验研究的附芍祛黄颗粒所用的就是附子炮制品（黑顺片），按照2020版《中华人民共和国药典》规定，经过炮制的附子，其双酯型生物碱（新乌头碱、次乌头碱和乌头碱）总量不得过0.010%，本实验中未检出乌头碱，新乌头碱和次乌头碱的总量为0.006 4%，结果符合药典规定，保障了临床用药的安全。