QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法同时测定柿子中螺虫乙酯及其四种代谢物残留

陈培玉，刘俊辉，刘丹黎，吴绪金，安 莉，李 萌*，白乐高*

(1. 河南省农业科学院基地管理中心，河南 郑州 450002；2. 河南牧业经济学院，河南 郑州 450002；3. 河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，河南 郑州 450002)

柿子为多年生落叶乔木，柿科柿属植物，含有大量的维生素、糖类、黄酮类、脂肪酸、酚类、微量元素等营养物质，具有很高的药用、经济价值。柿子生长中主要虫害有蚧壳虫、柿蒂虫、柿小叶蝉等。螺虫乙酯分子式为C21H27NO5，英文名称为(5s，8s)-3-(2，5-dimethylphenyl)-8-methoxy-2-oxo-1-azaspiro[4.5]dec-3-en-4-yl ethyl carbonate是拜耳作物科学公司研制的一种季酮酸类新型杀虫剂[1]。螺虫乙酯主要代谢产物有螺虫乙酯-烯醇-葡萄糖苷(S1 Spirotetramat-enol-glucoside)、螺虫乙酯-醇酮(S2 Spirotetramat-keto-hydroxy )、螺虫乙酯-烯醇(S3 Spirotetramat-enol)、螺虫乙酯-单-羟基(S4 Spirotetramat-mono-hydroxy)[2]。螺虫乙酯作用机理主要是通过影响脂质生物合成，致虫体死亡，从而达到防虫治虫目的。它是具有双向内吸传导特性的杀虫剂之一，渗透进叶片后被脱脂化，可同时存在于植物韧皮部和木质部，对隐蔽性强的害虫也有较好的防治效果。用于大豆、棉花等大田作物及常见果蔬植物体上的蚧科、粉虱、粉蚧、蚜虫、木虱等刺吸式口器害虫[3]。目前文献关于螺虫乙酯及其代谢物的研究主要有残留物检测方法研究、残留消解动态研究、膳食摄入评估研究等。已报道螺虫乙酯及其4种代谢物的检测方法有高液相色谱法[4-5]、液相色谱-三重四极杆串联质谱法( LC- MS)[6-7]、气相色谱-三重四极杆串联质谱法(GC-MS)[8]等。主要涉及作物为山楂[9]、枸杞[10]、龙眼[11]、柑橘[12]、猕猴桃[13]、梨[14]、番茄[15-17]、紫茄子[18]、苋菜[19]、豌豆[20]等。残留消解研究有土壤[21]、棉花[22]、辣椒[23]、大豆[24]等。膳食摄入评估研究有荚豌豆和豌豆[25]、甜椒[26]、常见水果[27]等。赵静等[28]研究了利用单克隆抗体结合酶联免疫法快速检测螺虫乙酯残留的方法。关于柿子中螺虫乙酯残留的检测方法尚未见报道，国家标准中也尚未确定其检测方法。本文在优化QuEChERS 前处理的基础上，建立高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪器检测方法，对柿子中螺虫乙酯及其代谢物进行了同时测定，为检测柿子中的螺虫乙酯及其代谢物的方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器设备 仪器：LC-30AD高效液相色谱仪；LCMS-805质谱仪；L-550型台式低速大容量离心机；KQ-5200DB型超声波数控清洗仪；VX-III-Multi-Tube Vortexer；FP-3010食品加工机；SQP系列和BSA224S型电子天平。

1.2 试剂和材料 螺虫乙酯标准品纯度98.5%；螺虫乙酯-烯醇-葡萄糖苷标准品纯度94.8%；螺虫乙酯-酮醇-羟基94%；螺虫乙酯-烯醇标准品纯度99.1%；螺虫乙酯-单-羟基标准品纯度99.7%。乙腈(色谱纯)；甲酸(色谱纯)；甲醇(色谱纯)；氯化钠(分析纯)；GCB净化剂(石墨化碳黑)；乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶净化剂(PSA)。供试柿子品种为“阳丰”，采自河南省农科院现代研究开发基地1号百果园内。

1.3 试验方法

1.3.1 试验样品的采集、制备 将田间采集的柿子样本放入带有干冰的泡沫箱中运至实验室，加干冰粉碎后，冷冻保存待测。

1.3.2 样品前处理 称取粉碎后的10g样品放入100mL离心管，加入20mL乙腈和2.5g氯化钠，将离心管置于多管涡旋振荡器中涡旋提取10min后，放入离心机，4 000r/min下离心5min，取2mL上清液至装有GCB和PSA(含量0.02g和0.05g)混合净化材料的2mL离心管中，再次涡旋震荡1min后，4 000r/min离心条件下离心5min，过0.22μm针孔滤膜，待液相色谱-三重四极杆串联质谱仪测定。

1.3.3 标准溶液配制 称取适量的螺虫乙酯、S1、S2、S3、S4标准品，经乙腈溶解定容成1 000mg/L的母液，用柿子空白基质配制标准溶液，浓度分别为0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L。

1.3.4 高效液相色谱条件 色谱柱：Shim-pack GISS(1.9μm，50mm×2.1mm)；柱温：40 ℃；流速：0.3mL/min；流动相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱条件(表1)。

表1 液相色谱流动相梯度洗脱条件

1.3.5 质谱条件 电离方式：ESI+(电喷雾离子源正离子)；碰撞诱导解离气(CID)：270 kpa；雾化气流量：3.0L/min；加热气流量：10L/min；接口温度：300℃；DL温度：250℃；加热块温度：400℃；检测方式：多重反应监测(MRM)，质谱参数(表2)。

表2 MRM模式下螺虫乙酯及其代谢物质谱参数

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择 甲醇、乙醇、乙酸乙酯等提取溶剂与水相溶，螺虫乙酯代谢产物在样品基质中极性较强不能被完全提取出来，乙腈易购买，用量少，有利于节约成本、减少试验废弃物对环境的污染，且乙腈作为提取溶剂时回收率为71%～97%，符合《农作物中农药残留试验准则》(NY/T 788-2018)的要求，最终选用乙腈作为提取溶剂。

2.2 净化材料选择 常用净化材料有PSA、C18和 GCB，其中PSA有效成分是其表面键合的氨基，对于样品中脂肪酸、有机酸、糖类、部分亲脂性色素具有较强的吸附作用，对水溶性色素的吸附作用较差；C18可以直接吸附去除样品中所含脂肪等非极性化合物；GCB对色素、类胡萝卜素等有较强的吸附净化能力。由于柿子中糖类、有机酸类、胡萝卜素含量较多，参考螺虫乙酯及其代谢物在枸杞[10]和甜椒[26]中残留检测时所使用的净化材料及用量，因此净化材料选择PSA和GCB，用量分别为0.05g和0.02g。

2.3 标准曲线 选取柿子空白基质溶液，按1.3.3配制标准液，在1.3.4高效液相色谱条件和1.3.5质谱条件下，以峰面积(A)-浓度(mg/L)作标准曲线(表3)，在0.005～0.500mg/L范围内，螺虫乙酯及其代谢产物S1、S2、S3、S4的绝对系数R2范围为0.991 4～0.999 7，均>0.99，呈现良好的线性关系。羊河等[9]报道螺虫乙酯及其代谢物S1和S3在山楂中的基质效应ME值分别为-29%、73%和24%，|ME|>20%，基质效应较强；S2和S4的基质效应ME值分别为-11%、6%，|ME|<20%，基质效应弱。为建立螺虫乙酯及其代谢物统一的前处理及仪器方法，减少基质效应对螺虫乙酯及代谢物S1和S3的影响，增加检测结果的可比性，本试验使用基质标准曲线进行定量。

表3 螺虫乙酯及其代谢物标准曲线和绝对系数

2.4 添加回收率与相对标准偏差 在柿子的空白对照样品中分别添加不同浓度的螺虫乙酯、S1、S2、S3、S4标准溶液，摇匀后静置30min，按照1.3.4中样品提取方法处理，添加回收率(表4)。在0.01、0.1、10mg/kg的添加水平下，柿子中螺虫乙酯的平均回收率为96%～104%，相对标准偏差为1.7%～2.6%；螺虫乙酯代谢物S1、S2、S3、S4的平均回收率分别为93%～103%、98%～102%、98%～102%、99%～101%，相对标准偏差分别为1.6%～3.4%、1.8%～4.7%、2.0%～4.5%、0.8%～3.3%。平均回收率和相对标准偏差均符合NY/T 788—2018[29]的规定。柿子空白样品色谱图(图1)，螺虫乙酯及其代谢物3个添加浓度的色谱图(图2～4)螺虫乙酯及其代谢物在优化后的该方法下，取得较好的分离效果，能够实现预期检测要求。

表4 柿子中螺虫乙酯及其代谢物添加回收率试验结果(n=5)

图1 柿子空白样品色谱图

图2 添加浓度为0.01mg/kg色谱图

图3 添加浓度为0.1mg/kg色谱图

图4 添加浓度为10mg/kg色谱图

2.5 最小最低检出浓度和检出量 螺虫乙酯及其4个代谢物的最低浓度均为0.01mg/kg；螺虫乙酯和S3的最小检出量均为5×10-13g，S1和S2最小检出量均为2×10-12g，S4最小检出量为1×10-12g。

3 结论

本试验建立了同时测定柿子中螺虫乙酯及其代谢产物的残留检测方法，优化了基于QuEChERS样品前处理下的高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法，柿子中螺虫乙酯及其4个代谢物的回收率为93%～104%，RSD为0.8%～4.7%，检测方法满足《农作物中农药残留试验准则》的要求。该检测方法操作便捷、检测分析用时短、反应灵敏度高，适用于柿子中螺虫乙酯及其代谢产物残留的测定。