柠檬烯异构体的气相色谱手性拆分和定量分析

2022-11-17石凯威高歆越姜宜飞吴进龙王诗雨

农药科学与管理 2022年10期

武鹏，石凯威，高歆越，姜宜飞，吴进龙*，王诗雨

(1.农业农村部农药检定所，北京 100125；2.中国农业大学理学院，北京 100193)

1 前言

柠檬烯属于单环单萜类化合物，化学名称为1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己烯，具有三种同分异构体，分别为右旋柠檬烯、左旋柠檬烯和消旋柠檬烯[1，2]，不同构型的柠檬烯的生物活性存在差异[3]，目前登记的柠檬烯有效成分均为d-柠檬烯，但已报到的柠檬烯分析方法如气相色谱法和气相色谱-质谱联用法[4-7]均不能对柠檬烯进行手性拆分。本文采用气相色谱法对柠檬烯中的l-柠檬烯和d-柠檬烯进行手性拆分和定量分析，该方法操作简便、快速、准确，分离效果好，准确度和精密度均能达到定量分析的要求。

2 试验部分

2.1 试剂和溶液丙酮(色谱纯)；苯甲酸甲酯(分析纯)；内标溶液：称取苯甲酸甲酯0.05g(精确至0.000 2g)，置于100mL容量瓶中，用丙酮稀释至刻度，摇匀，备用；d-柠檬烯标样，已知质量分数99.0%(sigma-aldrich)；l-柠檬烯标样，已知质量分数99.0%(sigma-aldrich)；5%d-柠檬烯可溶液剂(由某公司提供)。

2.2 仪器气相色谱仪 Agilent 7890A，具有氢火焰离子检测器和自动进样器；Agilent色谱工作站；色谱柱：30m×0.25mm(id) RestekRt-βDEXse毛细管色谱柱，膜厚0.25μm。

2.3 气相色谱操作条件温度(℃)：柱室温度：初始80℃，保留15min，以20℃/min升温至220℃，保留5min；气化室温度：220℃，检测室温度：240℃，载气(N2)：1.0mL/min；氢气：30mL/min，空气：300mL/min，进样体积：1μL，分流比：10：1，保留时间：d-柠檬烯约13.0min；l-柠檬烯约12.5min；内标物约18.3min。

d-柠檬烯标样、l-柠檬烯标样、内标物和5%d-柠檬烯可溶液剂的气相色谱图(图1、2)。

图1 l-柠檬烯、d-柠檬烯标样和内标物气相色谱图

图2 5%d-柠檬烯可溶液剂和内标物气相色谱图

2.4 测定步骤

2.4.1 标样溶液的配制称取l-柠檬烯标样0.05g(精确至0.000 2g)，置于100mL容量瓶中，用丙酮稀释至刻度，摇匀；移取1.0mL上述溶液于10mL容量瓶中，用丙酮稀释至刻度，摇匀；称取d-柠檬烯标样0.05g(精确至0.000 2g)，置于10mL容量瓶中，用丙酮稀释至刻度，摇匀；移取1.5mLl-柠檬烯标准溶液和1mLd-柠檬烯标准溶液，置于10mL容量瓶中，加入2mL内标液，再用丙酮稀释至刻度，摇匀，备用。

2.4.2 试样溶液的配制称取含d-柠檬烯的试样0.1g(精确至0.000 2g)，置于10mL容量瓶中，加入2mL内标液，再用丙酮稀释至刻度，超声3min，摇匀，冷却，备用。

2.4.3 测定在上述操作条件下待仪器基线稳定后，连续注入数针标样溶液，直至相邻2针标样溶液的响应值相对变化<1.5%后，按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。

2.4.4 计算将测得的2针试样溶液以及试样前后2针标样溶液中d-柠檬烯(l-柠檬烯)峰面积分别进行平均。试样中d-柠檬烯(l-柠檬烯)的质量分数ω(%)，按式(1)计算：

(1)

式中：

r1——标样溶液中d-柠檬烯(l-柠檬烯)与内标物峰面积比的平均值；

r2——试样溶液中d-柠檬烯(l-柠檬烯)与内标物峰面积比的平均值；

m1——标样的质量，g；

m2——试样的质量，g；

P——标样中d-柠檬烯(l-柠檬烯)的质量分数，%；

n——稀释倍数，n(l-柠檬烯)=2000/3，n(d-柠檬烯)=10。

3 结果与讨论

3.1 色谱条件的选择因d-柠檬烯和l-柠檬烯属于旋光异构体，且二者的沸点差异不大，采用常规的色谱柱不能进行有效拆分，且二者的碎片离子峰是一致的，采用气相色谱-质谱联用法也不能进行有效拆分[4-7]，本方法采用RestekRt-βDEXse手性毛细管色谱柱对柠檬烯进行拆分；依据柠檬烯物化性质，用丙酮作为溶剂溶解样品，为了得到更好的分离效果和峰形，用不同的升温条件在色谱柱上进行试验，最终确定温度(℃)：初始80℃，保留15min，以20℃/min升温至220℃，保留5min；在该条件下，d-柠檬烯和l-柠檬烯进行了有效拆分，且与杂质能得到很好的分离，峰形对称，基线平稳，能在短时间得到满意的分析结果，提高了工作效率。

3.2 分析方法的线性相关性试验按2.4.1中标样溶液的配制方法分别配制质量浓度为5.07、25.35、50.70、253.49、506.98、1013.96mg/L的l-柠檬烯标准溶液，质量浓度为5.08、25.41、50.83、254.13、508.27、1016.53mg/L的d-柠檬烯标准溶液，以d-柠檬烯(l-柠檬烯)的质量浓度为横坐标，d-柠檬烯(l-柠檬烯)与内标物峰面积比为纵坐标，绘制校正曲线。试验测得d-柠檬烯线性方程为y=1.277 95x+1.989 97，相关系数为0.996 89；l-柠檬烯线性方程为y=1.182 53x+1.774 80，相关系数为0.996 88。结果表明d-柠檬烯和l-柠檬烯在测试的质量浓度范围内线性关系良好。

3.3 分析方法的精密度试验从同一产品中准确称取5个试样，在上述色谱操作条件下进行分析，测得d-柠檬烯的标准偏差为0.066，变异系数为0.013%，l-柠檬烯的标准偏差为0.000 17，变异系数为0.023%(表1)。

表1 分析方法的精密度试验结果

3.4 分析方法的准确度试验从已知d-柠檬烯(5.20%)和l-柠檬烯(0.007 5%)质量分数的样品中称取5个试样，分别加入一定量的d-柠檬烯标样(99.0%)和l-柠檬烯标样(99.0%)，在上述色谱操作条件下进行分析，测得d-柠檬烯的平均回收率为100.41%，l-柠檬烯的平均回收率为101.72%(表2)。