不同醋酸棉酚添加量对绵羊体外发酵参数的影响

李运杰， 关 鹏， 任建刚， 贾梦可， 钱文熙*

（1.塔里木大学动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300；2.塔里木畜牧科技兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

随着我国畜牧业和饲料业的快速发展，蛋白饲料资源日益短缺（尹杰，2019），供求矛盾日益突出，价格也越来越高。棉籽粕饲料富含蛋白质，成本低廉，新疆拥有丰富的棉花资源，是我国乃至全世界最大的产棉区，资源量全球第一（朱晓芳，2020）。合理利用棉籽饼粕可为新疆地区生产发展提供有益帮助，但受多种因素制约，棉籽饼粕饲料综合利用率极低，其中最主要的原因是棉籽饼粕中含有抗营养因子棉酚，影响动物生长和健康（毛林峰，2014）。吕云峰（2010）按饲料卫生标准游离棉酚最大量1200 mg/kg为依据，对牛羊不同生长阶段推荐了10%~20%不等的棉籽粕安全限量。因此，本试验中棉酚添加量在0~1000 mg/kg。使用未脱毒的棉籽饼饲喂畜禽会导致畜禽中毒（朱晓春，2012），单胃动物棉酚中毒报道居多，少有反刍动物棉酚中毒报道，但长期饲喂棉副产品饲料也会导致中毒。

棉酚存在于棉籽中而各种加工方法都难以将其彻底清除。游离棉酚主要由活性醛基和活性羟基产生毒性而引起多种危害（Garry，2007），Chung（2000）研究结果表明，棉酚可以通过对膜基质和蛋白质分子的结合，以及通过负离子自由基机制对膜相结构的破坏和对电子传递体系的干扰，从多个方面干扰细胞的代谢，尤其是与钙离子依赖性蛋白激酶有关的代谢的干扰最强。刘军（2008）指出随着棉酚浓度的提高，组氨酸、半肮氨酸以及甘氨酸能有效降低棉酚对乳酸脱氢酶的抑制作用。瘤胃对游离棉酚具有解毒能力，在瘤胃内，游离棉酚与可溶性蛋白结合形成结合棉酚。Radominska-Pandya（2010）认为，反刍动物对棉酚的脱毒主要依靠瘤胃微生物，其原理可能是通过游离棉酚与微生物所分泌的酶、氨基酸或活性蛋白中的游离氨基结合，将游离棉酚转化为结合棉酚，从而达到脱毒效果。目前研究表明反刍动物对棉酚有一定耐受性，但能够承受的棉酚最大添加量还未确定，本试验通过体外产气法研究不同棉酚添加量对绵羊瘤胃发酵参数的影响，并建议绵羊饲料中棉产品中的棉酚安全含量。

1 材料与方法

1.1 试验动物饲养管理 选择健康状况良好、雌性、品种内体重差异不显著的绵羊[3岁，（40±2.0）kg]3只单圈饲养，自由采食和自由饮水，每日8：00和20：00各饲喂一次。

1.2 日粮设计 按照等能等氮的原则配制基础日粮，参考《动物营养参数与饲养》（张宏福，1998）中营养需要进行配方设计，具体日粮组成如表1所示。

表1 试验日粮组成及营养水平（风干基础）

1.3 试验设计 试验设6个处理组，分别为对照组、Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅴ组，每组12个重复培养体系。棉酚，由北京迈瑞达科技有限公司提供，纯度≥98%，占底物的添加含量分别为125、250、500、750 mg/kg和1000 mg/kg，对照组不添加棉酚，其他培养液和底物均相同，通过体外产气测定绵羊体外发酵参数。

1.4 瘤胃液的获取及人工瘤胃液的制备 瘤胃液采集：于晨饲前，通过瘘管取瘤胃上中下左右不同位点的瘤胃液，4层纱布过滤后放于提前预热（39℃）的保温壶中，迅速带回实验室。

人工瘤胃液制备：人工唾液根据MENKE（1988）等的方法制备。备齐所需培养液，并按1：2的比例向瘤胃液中加入提前通入二氧化碳并预热的人工唾液均匀混合，此发酵过程培养及样品持续通入二氧化碳处理。

1.5 体外发酵培养及样品的处理 精确称取标准棉酚0.0050 g，用1%醋酸的无水乙醇溶液溶解并定容至100 mL容量瓶，即得到0.05 mg/mL的醋酸棉酚溶液。精确称取发酵底物0.2000 g于注射器底部，将0.5 mL醋酸棉酚加入注射器底部的0.2000 g发酵底物上即得到125 mg/kg棉酚含量的发酵底物，250 mg/kg组添加1 mL、500 mg/kg组添加2 mL、750 mg/kg组添加3 mL、1000 mg/kg组添加4 mL醋酸棉酚溶液，对照组不添加醋酸棉酚，每组12个重复。注射芯在插入注射器前在其表面均匀涂抹凡士林，并小心插入注射器，注射器顶部套上三通阀。将配制完的人工瘤胃液吸至注射器内，此过程持续通入二氧化碳，每支30 mL，关闭注射器三通阀阀门，置于39℃恒温水浴摇床中振荡发酵，记录不同发酵时间点的产气量，48 h发酵后的发酵液立即进行pH测定，随后将发酵液3500 r/min离心10 min。取发酵液上清液于40 mL离心管-20℃保存，用于测定氨态氮和挥发性脂肪酸浓度。

1.6 测定指标 产气量：读取注射器上的刻度测定不同时间点（3、6、12、24、48 h）的产气量。

瘤胃pH：取样之后，立即利用pH计（FE22）快速测定pH。

氨态氮浓度：根据冯宗慈（2010）的比色法测定氨态氮含量。

挥发性脂肪酸测定：取出10 mL发酵液，10000 r/min离心15 min，取上清液1 mL，加入0.2 mL 25%偏磷酸溶液，用涡旋振荡器混合均匀，再以10000 r/min离心15 min，过0.22 μL微孔膜参照曹庆云等（2006）方法测定挥发性脂肪酸。

48 h干物质降解率和蛋白降解率：将48 h发酵后注射器中的残渣倒入尼龙袋，按照《动物营养与饲料科学实践教程》（钱文熙，2012）测定日粮干物质含量和蛋白质含量并根据公式计算降解率：

干物质降解率/%=（B－C）/B×100；

式中：B为待测样品中干物质的含量，%；C为待测样品尼龙袋残渣中干物质含量，%。

1.7 统计分析 用Excel对数据进行初步整理，SPSS 17.0处理软件中单因素方差分析进行显著性检验，LSD法多重比较其差异性，试验数据用“平均值±标准差”表示。P＜0.05为差异显著，P＞0.05为差异不显著。

2 结果

2.1 不同棉酚添加量对绵羊瘤胃产气量的影响由表2可见，随发酵时间的增长，各组的产气量逐渐增加，随棉酚添加量的增加各时间点的产气量逐渐下降，第Ⅰ组各时间点的产气量均低于对照组差异不显著（P＞0.05），第Ⅱ组、第Ⅲ组、第Ⅳ组和第Ⅴ组各时间点产气量均低于对照组差异显著（P＜0.05），即超过250 mg/kg棉酚添加量的发酵组产气量显著低于未添加棉酚的发酵组（P＜0.05），48 h时第Ⅱ组产气量比对照组降低了24.46%。

表2 不同棉酚添加量对绵羊产气量的影响

2.2 不同棉酚添加量对绵羊瘤胃pH的影响由表3可见，随棉酚添加量的增加，各发酵组瘤胃液在48 h时的pH呈下降趋势。对照组的pH最高与第Ⅰ组差异不显著（P＞0.05），第Ⅱ组、第Ⅲ组、第Ⅳ组和第Ⅴ组的pH显著低于对照组（P＜0.05），第Ⅱ组pH比对照组降低了0.62%。第Ⅱ组pH低于第Ⅰ组差异不显著（P＞0.05），第Ⅲ组pH显著低于第Ⅱ组（P＜0.05），第Ⅳ组pH低于第Ⅲ组差异不显著（P＞0.05），第Ⅴ组pH低于第Ⅳ组差异不显著（P＞0.05）。

表3 不同棉酚添加量对绵羊瘤胃pH的影响

2.3 不同棉酚添加量对绵羊瘤胃48 h干物质降解率的影响 由表4可见，随棉酚添加量的增加，各发酵组的48 h干物质降解率逐渐减少，对照组48 h干物质降解率最高，第Ⅰ组48 h干物质降解率低于对照组差异不显著（P＞0.05），第Ⅱ组、第Ⅲ组、第Ⅳ组和第Ⅴ组48 h干物质降解率呈下降趋势，且均低于对照组差异显著（P＜0.05），第Ⅱ组48 h干物质降解低于第Ⅰ组差异显著（P＜0.05）降低了7.07%，第Ⅲ组48 h干物质降解率低于第Ⅱ组差异不显著（P＞0.05），第Ⅳ组48 h干物质降解低于第Ⅲ组差异显著（P＜0.05），第Ⅴ组48 h干物质降解低于第Ⅳ组差异显著（P＜0.05）。

表4 不同棉酚添加量对绵羊瘤胃48 h干物质降解率的影响

2.4 不同棉酚添加量对绵羊粗蛋白降解率的影响 由表5可见，随棉酚添加量的增加，各发酵组的蛋白质干物质降解率逐渐减少，对照组粗蛋白质降解率最高，第Ⅰ组粗蛋白质降解率低于对照组差异不显著（P＞0.05），第Ⅱ组、第Ⅲ组、第Ⅳ组和第Ⅴ组粗蛋白质降解率呈下降趋势均低于对照组差异显著（P＜0.05），第Ⅱ组粗蛋白质降解率比对照组降低了3.85%，第Ⅱ组粗蛋白质降解率低于第Ⅰ组差异不显著（P＞0.05），第Ⅲ组粗蛋白质降解率低于第Ⅱ组差异不显著（P＞0.05），第Ⅳ组粗蛋白质降解率低于第Ⅲ组差异显著（P＜0.05），第Ⅴ组粗蛋白质降解率低于第Ⅳ组差异不显著（P＞0.05）。

表5 不同棉酚添加量对绵羊粗蛋白质降解率的影响

2.5 不同棉酚添加量对绵羊瘤胃氨态氮的影响由表6可见，随棉酚添加量的增加，各发酵组的氨态氮含量呈上升趋势，对照组的氨态氮含量低于第Ⅰ组差异不显著（P＞0.05），第Ⅱ组、第Ⅲ组、第Ⅳ组和第Ⅴ组氨态氮含量呈上升趋势均高于对照组差异显著（P＜0.05），第Ⅱ组氨态氮含量比对照组升高了13.73%，第Ⅱ组氨态氮含量显著高于第Ⅰ组（P＜0.05），第Ⅲ组氨态氮含量高于第Ⅱ组差异不显著（P＞0.05），第Ⅳ组氨态氮含量显著高于第Ⅲ组（P＜0.05），第Ⅴ组氨态氮含量显著高于第Ⅳ组（P＜0.05）。

表6 不同棉酚添加量对绵羊瘤胃氨态氮的影响

2.6 不同棉酚添加量对绵羊瘤胃挥发性脂肪酸的影响 由表7可见，随棉酚含量的增加，各发酵组的乙酸、丙酸、丁酸、乙酸比丙酸和总挥发性脂肪酸含量均呈下降趋势。对照组的乙酸、丙酸、丁酸和总挥发性脂肪酸含量均最高，均与第Ⅰ组差异不显著（P＞0.05），第Ⅱ组、第Ⅲ组、第Ⅳ组和第Ⅴ组的乙酸、丁酸和总挥发性脂肪酸含量呈下降趋势，与对照组差异显著（P＜0.05）。第Ⅱ组的乙酸、丁酸和总挥发性脂肪酸含量比对照组分别降低了16.19%、11.60%、20.84%。第Ⅱ组乙酸含量低于第Ⅰ组差异不显著（P＞0.05），第Ⅲ组、第Ⅳ组和第Ⅴ组乙酸含量差异不显著（P＞0.05）。第Ⅱ组丙酸含量低于第Ⅰ组和对照组差异不显著（P＞0.05），第Ⅲ组、第Ⅳ组和第Ⅴ组的丙酸含量呈下降趋势，与对照组差异显著（P＜0.05），第Ⅲ组丙酸含量比对照组降低了16.64%，第Ⅲ组丙酸含量显著低于第Ⅱ组（P＜0.05），第Ⅳ组丙酸含量显著低于第Ⅲ组（P＜0.05），第Ⅴ组丙酸含量低于第Ⅳ组差异不显著（P＞0.05）。第Ⅱ组丁酸含量低于第Ⅰ组差异不显著（P＞0.05），第Ⅲ组丁酸含量显著低于第Ⅱ组（P＜0.05），第Ⅳ组丁酸含量低于第Ⅲ组差异不显著（P＞0.05），第Ⅴ组丁酸含量低于第Ⅳ组差异不显著（P＞0.05）。对照组乙酸比丙酸含量最高，显著高于其他组（P＜0.05），第Ⅰ组、第Ⅱ组和第Ⅲ组乙酸比丙酸含量差异不显著（P＞0.05），第Ⅳ组乙酸比丙酸含量显著低于第Ⅲ组（P＜0.05），第Ⅴ组乙酸比丙酸含量低于第Ⅳ组差异不显著（P＞0.05）。第Ⅱ组总挥发性脂肪酸含量显著低于第Ⅰ组（P＜0.05），第Ⅲ组总挥发性脂肪酸含量低于第Ⅱ组差异不显著（P＞0.05），第Ⅳ组总挥发性脂肪酸含量低于第Ⅲ组差异不显著（P＞0.05），第Ⅴ组总挥发性脂肪酸含量低于第Ⅳ组差异不显著（P＞0.05）。

表7 不同棉酚添加量对绵羊瘤胃挥发性脂肪酸的影响 mmol/L

3 讨论

3.1 不同棉酚添加量对绵羊瘤胃产气量的影响瘤胃微生物可消耗饲料中的碳水化合物和粗蛋白质，产生二氧化碳、甲烷、氢气和低级脂肪酸等，当产气量越高，表明瘤胃微生物活性越高（雷冬至，2009）。产气量反映了瘤胃微生物的生长情况和饲料底物的降解程度，可发酵的营养物质越多微生物活性越强，产气量越大（徐子萱，2021）。本试验中，各发酵组的产气量随着时间的增加而增加，添加棉酚组的产气量均低于对照组，且随棉酚添加量的增多产气量呈下降趋势，添加250 mg/kg显著低于对照组，说明当棉酚添加量超过250 mg/kg时对绵羊瘤胃微生物产生影响，降低了微生物活性。王彩蝶（2019）研究发现，用棉酚含量为361 mg/kg和722 mg/kg的饲料饲养绵羊时，瘤胃液中的原虫数量逐渐降低，棉酚添加量的增加使原虫数量下降，抑制了瘤胃发酵，使产气量呈下降趋势。

3.2 不同棉酚添加量对绵羊瘤胃pH的影响瘤胃pH是评价瘤胃发酵的综合指标（冯帆，2020），反刍动物通过唾液分泌合成、吸收和排出瘤胃内挥发性脂肪酸和有机酸，反映了瘤胃微生物代谢产物的酸碱平衡状况（冯帆，2019）。瘤胃液的正常pH在5.5~7.5，过酸或过碱不利于瘤胃微生物发酵（郝建祥，2011）。本试验各发酵组48 h发酵后的pH均在正常范围内，说明缓冲液配制合理达到了稳定发酵环境的条件。本试验发酵48 h时对照组与添加250、500 mg/kg和750 mg/kg棉酚组的pH差异不显著，添加1000 mg/kg棉酚组与对照组差异显著。王海荣（2012）研究表明添加0、50、100 mg/kg和500 mg/kg棉酚对绵羊体外发酵48 h时的pH影响不显著，本试验结果与其一致。

3.3 不同棉酚添加量对绵羊瘤胃氨态氮和挥发性脂肪酸的影响 氨态氮是瘤胃氮代谢过程中外源蛋白质和内源含氮物质降解的重要产物，同时也是瘤胃微生物合成菌体蛋白的原料（王志敬，2017）。氨态氮含量越高说明合成的蛋白质越多。本试验中随棉酚添加量的增加瘤胃氨态氮含量呈下降趋势，瘤胃氨态氮浓度主要受瘤胃微生物合成蛋白的影响（孙国强，2013）。侯彩云（2012）研究表明添加棉酚发酵后瘤胃氨态氮含量高于未添加棉酚发酵组，本试验结果与其一致。Mena（2011）认为游离棉酚与瘤胃中的游离氨基酸结合。随游离棉酚含量的增加生成的结合蛋白增多，可能使瘤胃中的氨氮含量增多从而增加了氨态氮含量。饲料中的碳水化合物通过瘤胃微生物的代谢作用最终形成挥发性脂肪酸，挥发性脂肪酸的产量可显著影响反刍动物对营养物质的吸收、利用和生产能力的发挥（张华，2018）。本试验随棉酚添加量的增加乙酸、丙酸和丁酸含量呈下降趋势，250 mg/kg棉酚添加组显著低于对照组，与产气量的变化规律一致，进一步说明棉酚添加量超过250 mg/kg时，对瘤胃发酵有抑制作用。

3.4 不同棉酚添加量对绵羊干物质降解率和粗蛋白质降解率的影响 干物质降解率可反映反刍动物机体对饲料的消化能力，是评价不同饲料饲用价值高低的重要指标，越高说明瘤胃微生物活性越强、发酵效果越好（Zhang，2016）。导致粗蛋白质降解率差异的主要是饲料本身的蛋白质降解性和饲料中蛋白质结构、来源等因素的影响（Devant，2001）。张力莉（2014）通过体外产气法研究游离棉酚对瘤胃发酵的影响表明，随棉酚添加量的增加，干物质降解率呈下降趋势，本试验结果与其一致。干物质降解率和粗蛋白降解率是都是随棉酚添加量的增加呈下降趋势，通过上述结果表明，棉酚添加量超过250 mg/kg时饲料不易消化吸收，降低了反刍动物对粗蛋白质的利用。

4 结论

本试验结果表明：（1）随棉酚添加量的增加，产气量、pH、干物质降解率、蛋白质降解率和挥发性脂肪酸含量均呈现下降趋势，氨态氮呈现上升趋势。（2）125 mg/kg的棉酚添加量对瘤胃发酵无显著影响，超过250 mg/kg的棉酚添加量后对瘤胃发酵有抑制作用，因此建议绵羊饲料中棉产品中的棉酚含量不超过250 mg/kg。