茶树与梨树槲寄生中酚类和萜类化合物的结构鉴定

刘海哲，邹青飞，郭馨昕，陈壁，黄勇桦，张建平，初雅洁，李淳，刘先皓，杨士花，李永强*

（1.云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201；2.云南云测质量检测有限公司，云南 昆明 650201；3.德宏州食品药品检验所，云南 德宏 678400；4.凯里学院大健康学院，贵州 凯里 556011；5.滇西应用技术大学普洱茶学院，云南 普洱 665099；6.云南昆明国家粮食储备中转库，云南 昆明 650201；7.大理农林职业技术学院，云南 大理 671003；8.永平县综合检验检测院，云南 大理 671003；9.云南农业大学图书馆，云南 昆明 650201）

槲寄生[Viscum coloratum（Kom.）Nakai]属于檀香目（Santalales）的一种半寄生植物，主要寄生在桑科、茶科、蔷薇科和豆科等植物上[1]。在传统中医中被广泛用于治疗炎症、痛风、心脏病和高血压等疾病[2]。研究发现，槲寄生不仅含有蛋白质和碳水化合物等营养成分，还含有丰富的酚类化合物、萜类化合物、凝集素和生物碱等活性成分，对人体健康具有较好的促进作用[3]。酚类和萜类化合物具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌和抗病毒等作用[4]，受到人们的广泛关注。

茶树、梨树槲寄生在云南省主要分布于普洱、德宏和西双版纳等地区[5]。目前对茶树槲寄生多酚开展了一定的研究，但对梨树槲寄生的研究较少。倪婷婷等[6]测定了茶树槲寄生中多酚和黄酮的含量，并利用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法鉴定出12种酚类化合物，主要为黄酮醇和黄烷醇。研究发现茶树槲寄生的水提物对常见的食源性微生物和致病菌具有较好的抑菌作用[5]。同时，Li等[7]研究发现茶树槲寄生为扁枝槲寄生（Viscum articulatum Burm.f.），梨树槲寄生为枫香槲寄生（Viscum liquidambaricolum Hayata），这两种槲寄生中均含有丰富的多酚和黄酮，且均具有较好的抗氧化活性，并在两种槲寄生中鉴定出18种酚类化合物，主要包括羟基苯甲酸、羟基肉桂酸和类黄酮。

目前对茶树槲寄生中的酚类化合物进行了一定的研究，但梨树槲寄生中的活性成分研究较少，同时关于两种槲寄生中萜类化合物的研究鲜见。本文在前期研究的基础上，采用超高压液相色谱-四极杆飞行时间质谱（ultra-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）法，对茶树、梨树槲寄生中的酚类和萜类化合物进行系统的结构鉴定，可为茶树、梨树槲寄生的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茶树与梨树槲寄生：采自云南省普洱市景迈山；甲醇（色谱级）：德国Merck公司；乙酸（色谱级）：美国Sigma公司；乙腈（色谱级）：美国Honeywell公司。

1.2 仪器与设备

电子分析天平（FA2004）：沈阳龙腾电子有限公司；超声波清洗器（KQ-500B）：昆山市超声仪器有限公司；离心机（TGL20M）：湖南湘立科学仪器有限公司；超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱联用仪（1290 UPLC-6545Q-TOF）：安捷伦科技（中国）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

将粉碎干燥的槲寄生过40目筛，准确称取2.0 g槲寄生粉置于50 mL具塞锥形瓶中，加入20 mL甲醇并混匀，室温下超声辅助提取15 min，4℃下8 000×g离心10 min，重复提取3次，合并上清液用N2吹至近干，加入2 mL甲醇复溶，过0.2 μm有机滤膜，滤液用于UPLC-Q-TOF-MS分析。

1.3.2 UPLC-Q-TOF-MS分析条件

色谱条件：ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱温 40 ℃；进样量 2 L；流速0.3 mL/min；流动相：A为0.05%乙酸水溶液，B为乙腈；梯度程序：0 min，5%B；2 min，5%B；10 min，30%B；20 min，100%B。25 min处停止并继续运行4 min。

质谱条件：电喷雾离子源采用正/负离子源模式；干燥气温度300℃；干燥气流速6L/min；鞘气温度350℃；鞘气流速11 L/min；雾化器压力35 psi（1 psi=6.895 kPa）；毛细管电压3.5 kV；喷嘴电压1 kV；质量扫描范围m/z 100～1 000；采集模式 Full scan，Auto MS/MS。

1.4 结构鉴定

应用Masshunter工作站中的Agilent Masshunter Qualitative Analysis B.07.00、Masshunter PCDL Manager B.07.00和Agilent Masshunter Molecular Structure Correlator软件处理样品的原始质谱数据，确定每个峰的保留时间、m/z、MS/MS碎片离子，并计算对应的分子式和偏差。根据化合物的保留时间、分子式、m/z、MS/MS碎片离子等信息，并结合参考文献和数据库TCM Database@Taiwa（http：//tcm.cmu.edu.tw/）、Metlin（https：//metlin.scripps.edu）、Chemspider（https：//www.chemspider.com/）和 PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）对化合物的结构进行初步鉴定。采用ChemDraw软件绘制化合物的结构图和裂解规律图，采用Origin绘制样品的总离子流图。

2 结果与分析

样品经UPLC-Q-TOF-MS分析，正/负离子模式下的总离子流图见图1～图2。

图1 茶树槲寄生总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of Viscum coloratum（Kom.）Nakai hosted by Camellia assamica（Mast.）Chang in ion modes

图2 梨树槲寄生总离子流图Fig.2 Total ion chromatogram of Viscum coloratum（Kom.）Nakai hosted by Pyrus，i，f.in ion modes

鉴定出的酚类和萜类化合物的保留时间、m/z、MS/MS碎片离子等信息见表1。

表1 UPLC-Q-TOF-MS在正/负离子模式下鉴定茶树、梨树槲寄生中的酚类和萜类化合物Table 1 Phenolic and terpenoid compounds identifified in Viscum coloratum（Kom.）Nakai hosted by Camellia assamica（Mast.）Chang and Pyrus，i，f. by UPLC-Q-TOF-MS in both negative and

根据化合物保留时间、分子式、m/z、MS/MS碎片离子等信息，并结合数据库和参考文献从槲寄生中共鉴定出36种化合物。其中酚类化合物有17种，包括2种酚酸（甲基β-间苯二酚和间香豆酸），11种类黄酮化合物（蔷薇苷B、新圣草苷、橙皮素7-O-葡萄糖苷、山奈酚、山姜素、对香豆酰基三乙酸内酯、高良姜素、山奈酚-3-甲醚、6-5-羟基-7，3'，4'-三甲氧基-8-甲基异黄酮-5-新橙皮苷、乔松素和橘皮素），2种木脂素（鬼臼内酯苷和云南拟单性木兰素A）和2种香豆素（Libanorin和Heliettin）；萜类化合物有 19种，包括1种半萜（青蒿酸甲酯），3种单萜（黑麦草内酯、吐叶醇和氧化芳樟酯），3种倍半萜（青蒿甲素I、4-hydroxy-3-methoxy-2，10-bisaboladien-9-one和蜜环菌辛素），2种二萜（丹参新酮II和罗汉松内酯E），6种三萜（灵芝醇F、漫五酸、灵芝醇B、灵芝醇D、野鸦椿酸甲酯和松叶菊萜酸）和4种环烯醚萜（乙酰基梓醇、狭叶獐牙菜甙、杜仲醇和绣球茜草辛苷）。其中，两种槲寄生中含有9种相同的化合物。本试验在茶树、梨树槲寄生中新鉴定的化合物包括茶树槲寄生中甲基β-间苯二酚、蔷薇苷B和乙酰基梓醇3种酚类化合物，青蒿酸甲酯和松叶菊萜酸2种萜类化合物；梨树槲寄生中甲基β-间苯二酚、山姜素、云南拟单性木兰素A和鬼臼内酯苷4种酚类化合物，狭叶獐牙菜甙、青蒿甲素I和青蒿酸甲酯3种萜类化合物。

茶树、梨树槲寄生中含有丰富的酚类和萜类化合物，其中乔松素因其具有较好的抗炎和抗氧化活性，能够对肠缺血再灌注小鼠的肠黏膜和对乙酰氨基酚诱发的小鼠肝损伤发挥保护作用[8-9]；能够增加神经元的活性和谷胱甘肽的水平、降低乳酸脱氢酶的活性、抑制一氧化氮和活性氧的产生，具有一定的神经保护作用[10]；同时乔松素可保护体外培养的大鼠脑微血管内皮细胞免受氧-葡萄糖剥夺/再氧化的损伤，并能够增加线粒体膜电位，表明乔松素对体外血脑脊液屏障具有一定的保护作用[11]。

山姜素可通过减少炎症和氧化应激反应，改善脓毒症大鼠的急性肺损伤以及冠心病大鼠的心脏功能、血脂和血管内皮功能[12-13]；可以通过减轻子宫的组织学病变和降低髓过氧化物酶的活性，保护小鼠免受子宫内膜炎侵害[14]；能够抑制肾组织中肿瘤坏死因子和白细胞介素等炎症因子的产生以及核转录因子的活化，减轻肾脏损伤[15]；可通过抑制软骨细胞中炎症因子的表达保护脂多糖诱导的软骨细胞，促进软骨细胞增殖，能有效预防骨关节炎[16]。除此之外，山姜素具有一定的抑制肿瘤细胞增殖作用，是抗癌抗肿瘤研究的热点药物之一，可抑制胶质瘤干细胞的增殖和侵袭[17]；在SKOV3卵巢癌细胞系中以剂量和时间依赖方式抑制SKOV3细胞的集落和球体形成，并诱导其凋亡[18]；同时还可通过调节PI3/KAKT信号通路抑制肺癌的发展，并通过线粒体途径抑制胃癌细胞增长[19]。

橘皮素能有效缓解高强度运动诱发的人体皮质醇应激反应，抑制皮质醇过度分泌，提升人体抗氧化能力，加速体内炎症消除，促进身体机能的恢复[20]；可通过增强胰岛素的分泌调节肝酶活性，并能够降低血糖，从而达到预防糖尿病的作用[21]；同时橘皮素能够通过抑制神经系统、消化系统和泌尿系统相关细胞中的NF-κB通路发挥其抗炎功能，以及通过部分调节Nrf2信号通路降低肝脏中的氧化应激，进而缓解非酒精性脂肪性肝病[22]；除此之外橘皮素对双酚A诱导的氧化应激具有极好的改善作用，可降低双酚A诱导引起的肝脏损伤[23]。

山奈酚具有促进人体健康，预防多种疾病的功能。山奈酚可通过诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞黏附、迁移和侵袭等方式发挥其抗癌功效[24]；能够通过线粒体途径和内质网应激途径诱导HepG2细胞凋亡，具有潜在的抗肝癌活性，对癌症及心血管疾病具有一定的预防作用[25-26]。山奈酚能够通过调节炎症相关蛋白的表达以及抑制转录因子激活等方式，抑制炎症的发生和发展[24]；可抑制TLR4-NF-κB-NLRP3炎症信号通路，减少机体中炎症因子的合成与释放，增加抗炎因子的转录活性，能够保护肠黏膜机械屏障的完整，降低结肠的病理性损伤，减轻由葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠溃疡性结肠炎[27]。此外，山奈酚可以通过改善胰岛素敏感指数，增加胰岛素敏感性，发挥对糖尿病的防治功效[24]。

高良姜素能够清除氧自由基、减轻心肌细胞氧化脂质化，并通过抑制转录因子、肿瘤坏死因子、白细胞介素等炎症因子的表达，可抑制心肌细胞的肥大和死亡[28]；同时高良姜素可调节磷酸肌醇激酶和糖原合成酶激酶信号通路，降低心肌细胞凋亡，上调抗凋亡蛋白、降低凋亡蛋白基因表达，延缓心肌细胞过度损伤导致的纤维化[29]；此外高良姜素能下调转化生长因子、纤维连接蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、基质金属蛋白酶的活性，进而抑制心肌纤维化发生，同时调节丝裂原活化蛋白激酶，能够显著改善心脏收缩及舒张功能[30]。

综上所述，茶树、梨树槲寄生中的酚类和萜类化合物具有较好的生物活性，能够预防多种疾病和促进人体健康，可为茶树、梨树槲寄生在功能食品中的应用提供科学依据。

3 结论

本试验采用UPLC-Q-TOFMS法从茶树、梨树槲寄生中共鉴定出36种化合物，包括17种酚类化合物和19种萜类化合物。茶树槲寄生中鉴定出8种酚类化合物和11种萜类化合物，梨树槲寄生中鉴定出13种酚类化合物和13种萜类化合物，两种槲寄生含有9种相同的化合物。其中，新鉴定的化合物包括茶树槲寄生中甲基β-间苯二酚、蔷薇苷B和乙酰基梓醇3种酚类化合物，茶树槲寄生中青蒿酸甲酯和松叶菊萜酸2种萜类化合物；化合物甲基β-间苯二酚、鬼臼内酯苷、山姜素和云南拟单性木兰素A为梨树槲寄生中鉴定出的4种酚类化合物，化合物狭叶獐牙菜甙、青蒿甲素I和青蒿酸甲酯为梨树槲寄生中鉴定出的3种萜类化合物。说明茶树、梨树槲寄生中含有丰富的酚类和萜类化合物，可为茶树、梨树槲寄生的开发利用提供科学依据。