桑叶蛋白提取工艺优化及其酶解蛋白体外抗氧化活性

赵荣生，孙锡南，王鑫，王宗成*

（1.湖南科技学院创新创业学院，湖南 永州 425199；2.湖南科技学院化学与生物工程学院湖南省生物质资源综合开发利用工程技术研究中心，湖南 永州 425199）

桑叶作为药食同源的农副产品，拥有极高的营养价值和药用价值[1-2]，桑叶采收、除质、干燥后就可直接使用，具有降血糖、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗氧化、抗炎、延缓衰老、抗肿瘤和免疫调理等功效[3-8]。桑叶中含有生物碱、黄酮等多种生物活性化学组分[9-14]，此外桑叶还含有较为丰富的桑叶蛋白，桑叶粗蛋白含量可达到22.21%～32.38%，且氨基酸组成比例较适合人体吸收利用[15-18]。当前，国内对桑叶蛋白提取的研究报道较多，一般采用微波辅助提取法、超声波辅助提取法、纤维素酶辅助提取法、浸提法等方法提取桑叶蛋白[19-22]，但是桑叶蛋白的得率普遍不高，并且存在提取时间长、溶剂消耗大等问题[19-22]，此外，除了桑叶蛋白饲料、桑叶蛋白饮料外，对桑叶蛋白开发应用形成的产品不多[15-16，23]。当前，关于超声波细胞破碎法提取桑叶蛋白和通过酶解桑叶蛋白研究酶解蛋白的抗氧化活性研究鲜见。而超声波细胞破碎法可以快速破碎植物细胞，有助于有效成分的溶出，能高效、快速地提取有效成分[24]，因此，为了提高桑叶蛋白的得率和探索桑叶酶解蛋白的抗氧化活性，本研究采用超声波细胞破碎法提取桑叶蛋白，采用正交设计优化提取工艺条件，采用木瓜蛋白酶酶解桑叶蛋白，并研究了桑叶酶解蛋白的抗氧化活性，为桑叶蛋白资源进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桑叶：采摘于湖南科技学院种植的桑科植物的叶片，自然晾干，经粉碎机粉碎，过40目筛，得桑叶粉。牛血清白蛋白、木瓜蛋白酶（化学纯）：上海金穗生物科技有限公司；氢氧化钠、盐酸、考马斯亮蓝G-250、95%乙醇、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 [1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH]、亚铁氰化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三氯乙酸、三氯化铁（均为分析纯）：上海泰坦科技股份有限公司；试验用水为蒸馏水。

1.2 仪器与设备

离心机（TG16G）：湖南凯达仪器有限公司；恒温水浴锅（HWS28）：上海一恒科技有限公司；超声波细胞破碎仪（JYD-1200L）：上海之信仪器有限公司；紫外-可见分光光度计（UV1900）：青岛聚创环保设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑叶蛋白的提取

精确称取桑叶粉10 g，用浓度为0.5%NaOH溶液作为桑叶蛋白提取的浸提液，按照一定的液料比，用0.5%稀盐酸溶液调节浸提液的pH值，经超声细胞破碎仪破碎提取后，再经过一定时间的水浴加热浸提[24]，将浸提液离心，过滤，收集上清液定容，得桑叶蛋白提取液。

1.3.2 桑叶蛋白的含量测定

精确称取10 mg牛血清蛋白粉末置于100 mL容量瓶中，加去离子水使其完全溶解，再加去离子水定容至刻度，得100 mg/mL的蛋白质标准溶液。取6支具塞试管分别编号后，在试管中分别精确移取牛血清白蛋白标准溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别加蒸馏水 1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL，配制成浓度为 0、20、40、60、80、100 μg/mL的蛋白质标准溶液，然后在各支试管中分别加入5.0 mL浓度为100 μg/mL的考马斯亮蓝G250溶液，摇匀，放置2 min后在595 nm波长处测定吸光度，以牛血清白蛋白含量（μg/mL）为横坐标，以吸光度为纵坐标，制作牛血清白蛋白标准曲线[25]，得到线性方程：y=0.007 2x-0.003 3（R2=0.997 9）。取稀释的桑叶蛋白提取液1.0 mL，按照牛血清白蛋白标准曲线试验步骤，测定桑叶蛋白含量，根据公式（1）计算桑叶蛋白的提取得率。

式中：C为蛋白含量，μg/mL；V为提取液体积，mL；N为稀释的倍数；M为桑叶粉质量，g。

1.3.3 桑叶蛋白提取工艺的单因素试验

根据桑叶蛋白的提取方法，按照以下单因素试验进行桑叶蛋白提取：考察浸提液的 pH 值（2、4、6、8、10、12）、液料比 [8∶1、10∶1、12∶1、14∶1、16∶1、18∶1（mL/g）]、超声功率（100、200、300、400、500、600 W）、破碎时间（1、2、3、4、5、6 min）、浸提温度（20、30、40、50、60、70 ℃）、浸提时间（5、10、15、20、25、30 min）、浸提次数（1、2、3、4）对桑叶蛋白得率的影响。

1.3.4 桑叶蛋白提取工艺的正交试验优化

在单因素试验研究的基础上，通过考察各单因素对桑叶蛋白得率的影响以及各单因素水平对桑叶蛋白得率显著性差异，综合考虑选出对桑叶蛋白提取得率影响较大的4个因素，进行四因素三水平正交试验，研究超声细胞破碎法提取桑叶蛋白的4个要素相互作用的影响，优化桑叶蛋白提取工艺，确定最优提取条件。

1.3.5 桑叶酶解蛋白抗氧化活性研究

1.3.5.1 桑叶酶解蛋白的制备

参照文献[26]，将桑叶蛋白提取液调节pH值到等电点5[27]，静置，于8 000 r/min离心15 min，过滤，水洗，干燥得桑叶蛋白。称取桑叶蛋白样品0.5 g，用适量蒸馏水溶解，加入木瓜蛋白酶0.04 g，充分溶解混匀，定容至50 mL，置于55℃水浴下保温酶解反应3 h，取出于沸水中煮2 min，放置至室温，作为桑叶酶解蛋白。

1.3.5.2 DPPH自由基清除率的测定

参考田格等[28]的方法，精确量取2 mL不同浓度桑叶酶解蛋白溶液于试管中，加入4mL浓度为0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液，轻轻摇晃一下瓶身使其充分混匀，室温避光保存30 min后测定517 nm处吸光值A1；以2 mL样品溶液和4 mL去离子水混合作为对照组，测定其吸光值A2；以2 mL去离子水加入4 mL浓度为0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液混合作为空白溶液，测定吸光值A0。用相同浓度的未酶解桑叶蛋白和维生素C作对照。DPPH自由基清除率计算公式见式（2）。

1.3.5.3 总还原能力的测定

参考辛小丽等[29]的方法。采用普鲁士蓝还原法，准确量取2.5 mL不同浓度桑叶酶解蛋白溶液于离心管中，加入质量分数为1%亚铁氰化钾溶液2.5 mL和pH值为6.6的磷酸盐缓冲液1.5 mL，均匀混合在50℃下放置20 min，量取2.5 mL浓度为10%的三氯乙酸溶液混合，之后放入4 500 r/min离心机内离心10 min，取上清液2.5 mL，加入去离子水2.5 mL和质量分数为0.1%的FeCl3溶液2.5 mL，充分混匀均匀，放置10 min，在700 nm处测定吸光度，吸光度越大说明总还原能力越强。用相同浓度的未酶解桑叶蛋白和维生素C作对照。

1.4 数据处理

每组试验重复3次，以平均值作为结果；数据使用SPSS 20.0软件进行统计分析处理；用Origin 2018软件绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 不同pH值的浸提液对桑叶蛋白得率的影响浸提液的pH值对桑叶蛋白得率的影响如图1。

图1 浸提液的pH值对桑叶蛋白得率的影响Fig.1 Effects of pH value of extracted liquid on the yield of mulberry leaf protein

由图1可知，当pH值为2～8时，桑叶蛋白的得率逐渐增加P＜0.05），pH值超过8时，桑叶蛋白的得率减少，在浸提液的pH值为8时，蛋白质的得率最高。桑叶蛋白的等电点在pH5附近[27]，偏离等电点蛋白质溶解更完全，但是pH值过高，浸提液黏度增加，影响蛋白质等电点沉降[30]，因此，综合考虑选择浸提液的pH值为8。

2.1.2 不同液料比对桑叶蛋白得率的影响

液料比对桑叶蛋白得率的影响如图2。

图2 液料比对桑叶蛋白得率的影响Fig.2 Effects of ratio of liquid to material on the yield of mulberry leaf protein

由图2可以看出，随着液料比的增加，桑叶蛋白得率随浸提液体积的增大先上升后下降，在液料比为14∶1（mL/g）时，桑叶蛋白得率最大。当液料比超过14∶1（mL/g）时，过多的浸提液不仅浪费原料，而且得到的桑叶蛋白浓度会下降，使一些杂质被提取出来，导致得率下降[28]。因此，在考虑到生产成本和生产效率的基础上，选择最佳液料比为 14∶1（mL/g）。

2.1.3 不同超声功率对桑叶蛋白得率的影响

超声功率对桑叶蛋白得率的影响如图3。

图3 超声功率对桑叶蛋白得率的影响Fig.3 Effects of ultrasonic power on the yield of mulberry leaf protein

由图3可以看出，随着超声细胞破碎仪输出功率的增大，桑叶蛋白的得率先显著增高（P＜0.05），当超声细胞破碎仪输出的功率超过300 W后，桑叶蛋白得率略有下降。可能是随着超声细胞破碎仪输出功率的增加，超声破碎效果增加，当超声功率超过300 W时，随之热效应明显，超声温度增加明显，可能导致有部分桑叶蛋白被破坏，并且一些其他物质同时溶出，桑叶蛋白得率有所下降[31]。因此，考虑到生产效率，超声功率为300 W最佳。

2.1.4 不同破碎时间对桑叶中蛋白质得率的影响

破碎时间对桑叶中蛋白质得率的影响如图4。

图4 破碎时间对桑叶蛋白得率的影响Fig.4 Effects of crushing time on the yield of mulberry leaf protein

由图4可以看出，随着破碎时间的增加，桑叶蛋白得率不断增大（P＜0.05），在破碎时间为5 min时，桑叶蛋白得率达到最高，超过5 min蛋白质得率呈现下降的趋势。破碎时间过短，桑叶蛋白还没得到充分地释放，当提取达到饱和状态后，增加提取时间并不会增大蛋白质得率，反而有可能破坏桑叶蛋白[24]。因此，考虑到更好地提高生产效率、节省生产时间，选择破碎时间为5 min。

2.1.5 不同浸提温度对桑叶蛋白得率的影响

浸提温度对桑叶蛋白得率的影响如图5。

图5 浸提温度对桑叶蛋白得率的影响Fig.5 Effects of extraction temperature on the yield of mulberry leaf protein

由图5可知，桑叶蛋白得率随着浸提温度的变化呈现出先增加后减少的趋势，当浸提温度为40℃时，桑叶蛋白得率达到最大值。在40℃之前，蛋白质的溶解速率随着温度的升高而增加，当浸提温度超过40℃时，桑叶蛋白可能开始变性，桑叶蛋白得率逐渐降低[32]。因此，选择浸提温度为40℃。

2.1.6 不同浸提时间对桑叶蛋白得率的影响

浸提时间对桑叶蛋白得率的影响如图6。

图6 浸提时间对桑叶蛋白得率的影响Fig.6 Effects of extraction time on the yield of mulberry leaf protein

从图6可以看出桑叶蛋白得率随着浸提时间增加逐渐增加，当浸提时间超过15 min时，桑叶蛋白得率变化不显著（P＞0.05），可能随着浸提时间的延长，桑叶蛋白已经充分溶出。因此，为了节约时间，选择浸提时间为15 min最合适。

2.1.7 不同浸提次数对桑叶蛋白得率的影响

浸提次数对桑叶蛋白得率的影响如图7。

图7 浸提次数对桑叶蛋白得率的影响Fig.7 Effects of extraction times on the yield of mulberry leaf protein

由图7可以看出，随着浸提次数的增加，桑叶蛋白的得率先明显增加，后趋于平稳。桑叶在2次的浸提后桑叶中的蛋白质大部分都溶解出来，在浸提超过2次后，桑叶蛋白得率增加的幅度很少（P＞0.05），考虑到节约工艺的时间和材料成本，选择浸提2次。

2.2 正交试验结果

根据单因素试验的结果综合考虑，正交试验采取固定浸提液的pH值为8、浸提时间15 min、浸提2次的条件下，选择破碎时间、液料比、超声功率、浸提温度4个单因素进行四因素三水平L9（34）正交设计试验，试验结果如表1所示。

表1 正交试验结果Table 1 Orthogonal test result

由表1可知，桑叶蛋白提取的较优组合方案是A2B3C3D3，即液料比为 16∶1（mL/g），400 W 超声破碎处理5 min，浸提温度为50℃。根据极差R的大小结果得知，4个单因素中对桑叶蛋白的提取得率影响大小：A（破碎时间）＞B（液料比）＞D（浸提温度）＞C（超声功率）。

进一步通过方差分析讨论各因素对桑叶蛋白得率的影响，结果如表2所示。

表2 方差分析结果Table 2 Results of variance analysis

从正交试验的方差分析表中可以得到因素A（破碎时间）极显著，对结果有显著影响，其他因素对桑叶蛋白得率影响较小。因此，从经济角度出发，其他因素可以选择较小的料液比、较低的超声功率和较低的温度，进一步优化提取组合方案为A2B1C1D1，即液料比为12∶1（mL/g），200 W 超声破碎处理 5 min，浸提温度为30℃。为了验证正交试验的可靠性，根据上述优化的提取组合方案条件进行验证试验，每个试验重复3次，得到桑叶蛋白的平均得率达到了9.85%。与传统的提取方法相比，超声细胞破碎法提取桑叶蛋白的得率更高，并且提取时间更短[19-22]。

2.3 酶解桑叶蛋白抗氧化活性研究

2.3.1 DPPH自由基清除能力

酶解桑叶蛋白对DPPH自由基清除能力如图8所示。

图8 桑叶蛋白对DPPH自由基清除能力Fig.8 Scavenging ability of mulberry leaf protein to DPPH free radical

由图8中可以看出，桑叶酶解蛋白、未酶解桑叶蛋白和维生素C浓度对DPPH自由基清除能力均呈现正相关的关系。随着浓度增加，对DPPH自由基清除能力不断升高，说明桑叶酶解蛋白和未酶解桑叶蛋白都具有一定的DPPH自由基清除能力，并且桑叶酶解蛋白对DPPH自由基清除能力更强。当桑叶酶解蛋白浓度为2 mg/mL时DPPH自由基清除率达到65.3%，虽然活性弱于维生素C，但是明显强于同浓度下未酶解桑叶蛋白DPPH自由基清除率（35.6%），因此说明通过酶解可以提高桑叶蛋白的抗氧化活性，酶解桑叶蛋白对DPPH自由基具有较强的清除能力。

2.3.2 总还原能力

酶解桑叶蛋白的总还原能力如图9所示。

图9 桑叶蛋白的总还原能力Fig.9 Total reducing capacity of mulberry leaf protein

由图9可以看出，随着桑叶酶解蛋白、未酶解桑叶蛋白和维生素C浓度的增加，总还原能力试验中吸光度越来越大，说明总还原能力越来越强，桑叶酶解蛋白和未酶解桑叶蛋白都具有一定的总还原能力，虽然桑叶酶解蛋白活性弱于维生素C，但是比未酶解桑叶蛋白具有更强的总还原能力。

3 结论

本研究采用超声波细胞破碎法提取桑叶蛋白，考察了浸提液的pH值、液料比、超声功率、破碎时间、浸提温度、浸提时间、浸提次数7个因素对桑叶蛋白提取得率的影响。通过对单因素试验结果的探究，设计正交试验优化提取工艺条件，优化后得出最佳提取工艺条件：浸提液的 pH 值为 8，液料比为 12∶1（mL/g），超声功率200 W下处理5 min，在30℃下水浴15 min浸提2次，在此条件下，桑叶蛋白的得率为9.85%。此外，通过酶解可以提高桑叶蛋白的抗氧化活性，桑叶酶解蛋白不仅具有一定的还原能力，还对DPPH自由基具有较强的清除能力，为桑叶蛋白资源开发提供理论依据。