应用EBER-RNA探针原位杂交技术检测鼻咽癌组织中的EB病毒

李燕红，周刘勇，刘倩文，吴奕晗，周显

东莞康华医院 病理科，广东 东莞 523000

0 引言

鼻咽癌是指发生在鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤，其发病率居耳鼻咽喉恶性肿瘤首位[1]。既往研究表明[2]：鼻咽癌呈加剧聚集现象，其发病多与易感基因、病毒感染及环境因素有关，临床多表现为涕中带血、听力下降及耳闷堵感等。既往研究表明[3]：EB病毒（EBV）感染与鼻咽癌的发生、发展有关，而EBER是EBV基因转录的小分子RNA，存在于EBV感染的细胞核中。传统的原位杂交技术用于EBV-DNA中，虽然能获得较高的检出率，但是诊断灵敏度较低，检测步骤较为烦琐。而EBERRNA探针原位杂交技术是一种新型的检测方法，借助EBER的反义寡核苷酸，利用单链RNA与EBER的互补杂交，不仅能实现EBV的检测，亦可提高诊断灵敏度[4]。因此，本研究以疑似鼻咽癌患者为对象，探讨应用EBER-RNA探针原位杂交技术在鼻咽癌组织中EB病毒的检测效果，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2019年6月-2021年6月鼻咽癌患者109例作为对象，男81例，女28例；年龄18～81岁，平均（49.64±7.85）岁；阳性77例，阴性32例；鼻咽癌65例，其他恶性肿瘤33例，良性病变11例。

1.2 纳入、排除标准

纳入标准：①符合鼻咽癌诊断标准[5]，经病理组织检查确诊；②均能完成标本采集，且患者均可耐受；③具有完整的报告，且标本采集前均未行放化疗治疗。排除标准：①精神异常、认知功能异常或器质性疾病者；②其他部位恶性肿瘤、转移瘤或严重肝肾功能异常者；③自身免疫系统疾病、凝血功能异常者。本研究患者及家属均知情同意，医院伦理委员会批准研究进行。

1.3 方法

1.3.1 标本采集

所有疑似鼻咽癌患者均经病理组织检查确诊，术中取病灶组织，将上述获得的标本经10.0%中性缓冲福尔马林溶液进行固定，常规酒精梯度脱水后，二甲苯透明，浸蜡后完成石蜡包埋，备用。

1.3.2 检测方法

采用EBER-RNA探针原位杂交技术测定不同组织中EB病毒检出率，EBER-RNA探针试剂为河南赛诺特公司供应，具体操作方法如下：

（1）实行标本预处理。取蜡块组织，常规制备4～6μm切片，并采用粘附性载玻片进行捞片，将其放置在62～65℃恒温箱中烤片2～4h，二甲苯脱蜡10min×3次，去除多余液体，入无水乙醇，浸泡3min×3次，取出经空气干燥完成5～10min。

（2）实行酶处理。结合切片上组织大小，加入80～100μL胃酶工作液，温箱中孵育5～20min，设定温度为37℃；上述操作完毕后，去除胃酶工作液，并完成酒精梯度脱水（75%、95%、100%各2min）。

（3）实行杂交及冲洗。上述操作完毕后，滴加5～10μL经地高辛标记的EBER-RNA探针，并放置盖玻片，橡胶水封边，37℃杂交孵育2～4h或过夜（原位杂交仪内或湿盒内）；操作完成后，将切片放置在PBS缓冲液中浸泡10min，待盖玻片自然脱落后给予PBS缓冲液冲洗2min×3次。

（4）实行DAB显色、复染及封片。根据组织的大小，滴加30～50μL HRP标记的抗地高辛抗体，37℃孵育30min，采用PBS连续完成3次冲洗，每次2min，去离子水冲洗2min后将切片放置在DAB中完成5～10min显色；自来水冲洗，苏木素复染5～10s，分化、返蓝，常规酒精梯度脱水后，二甲苯透明，封片。

1.3.3 不同病理状态下EB病毒检出

查阅患者病历资料，记录不同性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、肿瘤分期、淋巴结转移等，分析不同病理状态下EB病毒检出率。

1.4 统计学分析

采用SPSS 24.0软件处理，计数资料行χ2检验，采用[n（%）]表示，计量资料行t检验，采用（）表示，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织中EB病毒检出率比较

82例鼻咽癌患者均完成病灶组织收集，结果表明：鼻咽癌患者病灶组织中EB检出率高于非鼻咽癌患者组织中（P＜0.05），且阳性EBV信号定位于细胞核中，多呈深棕色，染色相对较浓，见表1和图1。

表1 不同组织中EB 病毒检出率比较[n（%）]

图1 不同组织中染色示意图（×200）

2.2 疑似鼻咽癌患者EB病毒检出率比较

鼻咽癌患者中EB病毒检出率年龄、性别无统计意义（P＞0.05）；与肿瘤发生部位、肿瘤类型具有统计意义（P＜0.05），见表2。

表2 鼻咽癌不同病理下EB 检出率比较

2.3 疑似鼻咽癌患者EB病毒检出率多因素Logistic回归分析

多因素Logistic回归分析结果表明：疑似鼻咽癌患者EB病毒检出率与肿瘤发生部位、肿瘤类型具有统计意义（P＜0.05），见表3。

表3 疑似鼻咽癌患者EB 病毒检出率多因素Logistic 回归分析

3 讨论

既往研究表明：EB病毒在鼻咽癌的发生及发展中发挥了重要的作用，加强其表达测定能实现鼻咽癌的早期筛查与诊断[6-7]。临床上，将鼻咽癌分为角化型、非角化型与基底细胞样型鼻咽癌三种，但是无论何种类型鼻咽癌均与EB病毒有关[8-9]。本研究中，109例疑似鼻咽癌患者均完成病灶组织的收集，结果表明：病灶组织中EB检出率高于癌旁组织中（P＜0.05），且阳性EBV信号定位于细胞核中，多呈深棕色，染色相对较浓，从本研究结果看出，EBER-RNA探针原位杂交技术用于鼻咽癌组织中EB病毒检出率较高，能辅助临床诊疗。EBER-RNA探针原位杂交技术是一种新型的检测技术，测定时采用EBER的反义寡核苷酸，一种RNA作为探针，借助该单链RNA与EBER互补杂交，能确定患者是否感染EB病毒，且临床诊断灵敏度较高[10-11]。本研究中，鼻咽癌患者中EB病毒检出率与肿瘤发生部位、分化程度、肿瘤分期、淋巴结转移具有统计意义（P＜0.05），说明EBER-RNA探针原位杂交技术测定鼻咽癌患者EB病毒能反应患者疾病严重程度。EBER-RNA探针是一种短片段的单链RNA，原位杂交时不需要经过高温变性处理，与探针孵育过夜即可获得良好的杂交效果，从而避免使用双联DNA探针进行杂交时复性问题，有助于提高检测敏感性[12]。本研究中，多因素Logistic回归分析结果表明：疑似鼻咽癌患者EB病毒检出率与肿瘤发生部位、肿瘤类型具有统计意义（P＜0.05）。从本研究结果看出，鼻咽癌组织中EB病毒检出率受到的影响因素较多，不同因素能相互作用及影响。因此，临床上鼻咽癌患者应加强EBER-RNA探针原位杂交技术测定，以提高EB病毒检出率[13-15]。

综上所述，EBER-RNA探针原位杂交技术用于鼻咽癌组织中EB病毒检出率较高，能反映患者病情严重程度，可指导临床治疗。