肉及肉制品真实性鉴别技术的研究进展

王柏辉，周晋尧，周霞，孙亚婷，薛彦伦，吕树梅

1. 鄂尔多斯市检验检测中心（鄂尔多斯 017000）；2. 鄂尔多斯市农牧业科学研究院（鄂尔多斯 017000）

根据《中国居民膳食指南》要求，肉及肉制品是日常饮食中必不可少的一部分，每人每天应摄入100 g左右的肉制品。肉制品中蛋白质含量约占20%，同时畜肉中的营养物质，如亚油酸、维生素、矿物元素等比较丰富[1]。伴随着市场经济的高质量发展，消费者对肉及肉制品的需求越来越多样化，对肉制品的感官质量和营养品质愈加重视，而在经济利益的驱使下，近年来肉制品掺假掺杂事件频频发生[2]。2013年欧洲的“马肉风波”事件和2016年大润发肉类掺假事件揭示商家以廉价肉代替高价肉售卖，以牟取暴利。肉制品的掺假主要体现在：原料肉的掺假；肌肉组织替换，如用动物脂肪组织替换肌肉组织；添加植物蛋白等。

针对肉制品安全性监管和保护消费者利益，全球各个国家食品安全部门对肉及肉制品生产者和经营者具有明确的法律法规约束，但也需要借助科学技术手段以保障食品安全。常见的肉制品真实性鉴别方法包括分子生物学技术、振动光谱技术、质谱和色谱技术、免疫检测技术和代谢组学技术。肉制品真实性鉴别技术是监管肉制品掺假掺杂和维护市场安全流通的有效保障，同时肉制品掺假掺杂形式的多样化决定了鉴别技术的准确性和多样性，如何提升肉制品鉴别技术的准确性和便利性以及扩大鉴别技术的应用范围是目前保障肉制品安全的发展方向。

1 分子生物学技术在肉及肉制品真实性鉴别中的应用

分子生物学技术已成为肉及肉制品真实性分析领域的常规工具，允许在复杂基质中对不同物种进行精准鉴别。DNA是生物体细胞中主要遗传物质，在不同物种中具有较高的保守性。生物体细胞中DNA具有耐热性和稳定性的特性，被广泛用于肉制品掺假掺杂检测中[3]。分子生物学技术主要包括聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术、基因芯片、DNA条形码和电化学DNA传感器。

1.1 PCR技术

PCR技术是针对指定的DNA序列设计引物，利用DNA聚合酶在体外循环扩增，实现目标DNA快速扩增。PCR技术因具有特异性高、灵敏度强、反应效率高且成本相对较低等优点，已成为肉制品真实性鉴别的常用技术方法。应用在肉及肉制品真伪检测的PCR技术主要包括多重PCR技术、实时荧光定量PCR技术和数字PCR技术。

多重PCR技术是基于在同一PCR反应体系当中加入2对及以上的引物，对单一样本同时准确扩增多个核酸片段，进而完成对多个肉类品种的准确分析。Prusakova等[4]基于8个物种线粒体ATPase基因序列间的差异，设计特征引物，引物对于不同的DNA来源没有交叉反应。用建立的多重PCR技术鉴别牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、火鸡肉、猫肉、狗肉和老鼠肉，该方法可以同时精准鉴别8种肉类，灵敏度能达到30 pg DNA。Ali等[5]基于ND5、ATPase6和CytB基因设计5对引物，利用多重PCR技术可同时鉴别5种动物（猫、狗、猪、猴和鼠），该方法的灵敏度在0.01～0.02 ng DNA。

实时荧光定量PCR技术是在PCR体系中加入染料或者探针等荧光基团，通过荧光信号强度变化实时监控反应中DNA浓度的变化，从而实现对肉及肉制品进行鉴别，通过DNA的浓度和CT值间的线性关系实现定量。Wang等[6]建立利用实时定量PCR技术鉴别山羊肉中猪肉的方法，猪肉添加量在5%～80%之间，山羊肉和猪肉的比值与CT值间的线性条件较好。同时，Xu等[7]建立实时定量多重PCR技术鉴别不同肉源（鸭肉、猪肉、鸡肉和牛肉），该方法效果较好，准确度约98%，单个物种的灵敏度为0.01%。

微滴数字PCR是近年来迅速发展的一种核酸精准定量技术，通过将模板大量稀释到单个反应单元进行目标分子的PCR扩增，根据荧光信号，通过阳性反应器的数量计算目标序列的拷贝数。其优点是直接完成DNA的绝对定量，而不需要标准曲线。Chen等[8]应用微滴数字PCR技术分别建立牛肉及其制品中猪肉和鸭肉的含量检测的方法，该方法样品中DNA浓度的最低检出限和最低定量限分别为0.001%和0.01%，并应用该方法对市场样品检测，效果良好。Cao等[9]基于细胞色素B基因（cytB基因）应用微滴数字PCR法建立鲳鱼物种鉴定和定量的方法，该方法的绝对检测限和定量限分别为2拷贝/mL和21拷贝/mL。

1.2 DNA条形码技术

针对未知样品检测，DNA条形码技术是近年来兴起的用于肉类真伪鉴定的新型技术。该技术其原理就是依靠标准、能够变异、容易扩增并且相对较短的DNA片段，该片段在物种内具有足够的特异性和种间足够的多样性，能够实现对物种进行快速、准确识别和未知物种鉴定，类似于商店的商品标签码。励炯等[10]基于线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因（COI基因）的DNA微条形码技术建立牛羊肉制品中6种廉价肉的掺假鉴定方法，所有肉类的扩增效率都为100%，廉价肉的检出限都在10%以内，该方法灵敏度合适，前处理简单，可用于高经济价值的熟肉制品中掺杂掺假鉴定。Cottenet等[11]利用高通量测序技术构建复杂样品的多物种DNA条形码鉴别技术，成功分析46种纯肉类和混合肉类物种，包括一些近缘物种，如野牛与牛肉。此外，该方法也适用于加工肉制品的鉴定。

2 光谱技术在肉及肉制品真实性鉴别中的应用

近年来光谱技术逐渐被应用于食品安全分析，是无损检测的重要技术之一。光谱技术应用原理是在不同波长下肉及肉制品中一些基本营养成分如水分、脂肪、蛋白质、脂肪酸或氨基酸等小分子化合物产生光谱不同。该技术具有前处理方法简单、检测速度快和不破坏样品营养物质等优点。光谱技术在肉及肉制品真实性检测方面，主要有红外光谱法、拉曼光谱技术和高光谱成像技术。

红外光谱（infrared spectroscopy，IR）是指频率在780～25 000 μm之间的电磁波，能引起分子中振动能级和转动能级的跃迁，不同物质通过检测分析红外线被吸收情况而得到的红外光谱。近红外光谱法和中红外光谱被广泛应用于肉制品掺杂掺假的检测控制。Leng等[12]利用近红外光谱技术结合偏最小二乘判别分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）和偏最小二乘回归分析（partial least squares regression，PLSR）建立牛肉制品中猪肉和鸭肉成分鉴别方法，结果表明，判别分析模型能够区分牛肉与猪肉和鸭肉的比率分别为100%和91.5%，而PLSR模型区分牛肉与猪肉和鸭肉的比率95.80%和95.69%。MAbood等[13]利用傅里叶近红外光谱对38种肉源中猪肉进行检测，结果表明，基于PCA分析和PLS-DA都能够快速准确地区分猪肉与其他肉类，且所建立的PLSR模型对掺假鉴别准确率为97.74%。另外，国外研究者采用中红外光谱结合PLS-Kernel预测模型分析建立牛肉及其制品中猪肉的鉴别方法，该方法的猪肉最低检出限为1.4%，该方法的应用对于清真食品安全管理具有广阔的前景[14]。

拉曼光谱（Raman spectra，RS）是由物质分子对光源的散射产生的一种非破坏性的指纹成像技术。拉曼光谱与入射光强度无关，与样品组成物质本身的极化率有关，并结合化学计量学实现肉制品掺假鉴别。Nunes等[15]基于功能性成分氨基酸、脂肪和蛋白质建立RS结合PLS-DA的模型，可以准确分析出猪肉产品中的非肉类成分卡拉胶，该方法效果显著。Al-Sarayreh等[16]利用拉曼光谱建立不同动物油脂（牛油、猪油、鸡油和鸭油）的鉴别方法，在牛油中从0～50%添加猪油和鸭油进行检测，表明该方法线性条件较好。

高光谱成像光谱技术（Hyperspectral imaging spectroscopy，HIS）是将光谱技术与图像处理技术相结合，可以同时获得光谱分辨率和空间分辨率，快速高效的获得光谱数据信息和空间信息。由于快速、无损和无复杂的前处理等优点，被用于肉制品掺杂掺假的鉴定研究中。Zhang等[17]利用高光谱成像收集不同状态的羊肉、牛肉和猪肉肌肉的扫描图像数据集，并使用深度卷积神经网络（CNN）模型提取光谱和空间特征，对红肉制品掺假进行综合分析，结果表明，CNN模型在不依赖于产品状态的情况下，总体分类准确率达到94.4%，可以作为快速、可靠、无损检测红肉制品掺假的有力工具。Jiang等[18]基于高光谱成像技术研究肉馅中内脏掺杂掺假情况，通过对180个掺假样品分析，建立PLSR模型，该模型的预测系数为98%，误差为4.25%。

3 色谱、质谱技术在肉及肉制品真实性鉴别中的应用

色谱、质谱技术是定性和定量肉及肉制品中蛋白质和多肽的基本常用工具，色谱技术与质谱技术联合可精准分析复杂物质的成分和含量，该技术具有检测速度快，仪器灵敏度高，应用范围广的优点。色谱技术是基于蛋白质和多肽的特性，选择合适的流动相在相应的固定相进行洗脱，不同物质或成分以不同速度在固定相中移动，最终达到分离的效果。质谱技术是利用蛋白质组学的研究思路，基于蛋白质酶解产物多肽的离子质荷比，得到每个肽段的一级和二级质谱图，依靠蛋白数据库（Uniprot和NCBI蛋白数据库）进行比对，寻找特异性多肽。因此，基于色谱技术和质谱技术结合使用可实现蛋白或多肽的鉴别。Wang等[19]基于LC-QTOF-MS技术从5种动物肉源（牛、羊、猪、鸡和鸭肉）中筛选出56个特征多肽，再通过LC-MS/MS对特征肽段的特异性进行筛查，最终分别得到4，3，3，6和4条多肽片段被用于牛、羊、猪、鸡和鸭肉的鉴别。Hu等[20]基于特征肽段GDSVAYGLK作为标记物，利用UPLC-MS/MS技术建立测定水牛、牦牛、绵羊和山羊肉中骨桥蛋白含量的方法，该方法的测定结果与酶联免疫吸附试验实验结果一致。李莹莹等[21]利用LC-Q-Orbitrap-MS技术对羊肉中鸭肉掺假情况进行研究，筛选出鸭肉的专属多肽152条。利用LC-MS/MS技术对鸭肉特异性进行筛查，最终确定10条鸭肉肽段作为定性离子的母离子，并通过不同比例添加模拟掺假样品进行定量研究，研究结果表明该方法的鸭肉的最低检出限是0.5%。Stachniuk等[22]基于LC-QTOF-MS/MS技术在兔肉中筛选了区别于其他物种的49个热稳定性肽段，而在兔肉加工肉制品中只检测到稳定性强的3个肽段，分别为SSVFVADPK，AFFGHYLYEVAR和PHSHPALTPEQK，可被用于兔肉加工肉制品的鉴别分析。Fornal等[23]通过不同的食品加工方式，比如均质化、蒸煮、烤制、干燥和杀菌处理后，筛选出鸡、鸭和鹅肉中热稳定性较强的特征肽段。利用LC-MS技术建立快速筛查加工肉制品中鸡、鸭和鹅肉的鉴别方法，该方法可用于肉制品掺假和食品标签与成分相符检测等食品安全监管领域。

4 免疫学检测技术在肉及肉制品真实性鉴别中的应用

免疫学检测技术是基于抗原和抗体的特异性结合，实现样品的分析检测。其中，酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）技术是免疫学检测技术的常用的技术手段，主要包括间接酶联免疫分析和夹心酶联免疫分析。酶联免疫技术的工作原理是抗原或抗体吸附在固相载体表面，酶结合抗原或抗体后仍保持其酶活性与免疫活性，通过加入相应的抗原或抗体进行反应，根据底物颜色的变化来判断免疫反应的进程。ELISA技术具有特异性强、成本低和操作简单等优点，被广泛应用到肉及肉制品真实性的甄别。国外研究者开发一种夹心ELISA试剂盒能够快速量化检测在煮熟马肉、猪肉、牛肉、鸡肉和羊肉中猪肉的含量，该方法中蒸煮和高压处理得到的熟制猪肉的检出灵敏度分别为0.000 14%和0.000 4%，且定量分析范围为0.05%～3.2%[24]。Kuswandi等[25]基于抗猪免疫球蛋白G抗体开发一种横向流动免疫传感器用于牛肉加工制品中猪肉掺假检测，该方法检出限为0.01%，并与市售ELISA试剂盒比对，试验发现结果准确可靠。Benli等[26]利用酶联免疫技术和PCR技术对60份商业牛肉发酵香肠中鸡肉掺假现象进行研究，结果表明，2种检测方法的检测结果一致，5份样品存在鸡肉掺假情况。由于酶联免疫检测技术对抗体的特异性要求高，且受到肉制品的加工方式等条件的影响较大，因此，需要其他技术手段的辅助检测。

5 代谢组学技术在肉及肉制品真实性鉴别中的应用

组学技术是较热门的科学研究手段，其中代谢组学是以高通量检测技术和多元数据分析为手段，通过研究机体代谢物（分子量＜1 500 Da）的差异变化，进而探究代谢机制的新技术。在肉品科学领域随着代谢组学技术的不断拓展和应用，涉及肉品安全、肉品营养与风味和肉品加工等多个方面。代谢组学的基本原理是基于代谢图谱分析和代谢标志物的筛选来实现肉及肉制品安全性和真实性分析和鉴别。

根据肉及肉制品中代谢物的差异，代谢组学技术实现对牛肉、羊肉和猪肉的有效鉴定。Pavlidis等[27]利用顶空固相微萃取与气相色谱质谱法对牛肉中添加不同比例的猪肉进行代谢物分析，结果发现混合样品中2-丁醇和1-辛烯-3-醇是主要代谢物，同时建立一种基于挥发性指纹图谱的鉴别方法，鉴别正确率达99%。同时，对牛肉和马肉样品中甘油三酯图谱的差异研究表明，马肉中含有较高比例的多不饱和脂肪酸，因此可根据脂质组学分析结果来判别牛肉中马肉的掺假情况[28]。另外，孟新涛等[29]研究基于气相离子迁移谱技术建立羊肉中猪肉和鸡肉掺假鉴别的方法，结果表明羊肉中猪肉的添加比例大于5%时，正己醇、2, 3-丁二酮、羟基丙酮等39种主要风味物质的含量在增加，而2-乙基-1-己醇、芝麻酚、2-戊酮的含量在降低；羊肉中鸡肉的添加比例大于10%时，混合物的主要风味物质正己醇、3-甲硫基丙醛、反-2-辛烯醛的含量在降低，而甲醛等风味物质在增加。

6 结语

肉及肉制品的掺假现象是畜肉产业发展中存在的重要问题，所涉及的鉴别技术方法是近几年应用于肉及肉制品真实性鉴别的主要技术手段。分子生物学技术的优点在于特异性强、灵敏度高，对肉及肉制品掺假检测应用广泛，但需要开发精准的定量检测方法。光谱技术具有制样简便、无损、绿色与高效等特点，但基于化学计量学所建立的模型预测效果受诸多外界条件的影响，通用性不强。ELISA技术的优点是易于操作，使用范围广泛，分析时间短、灵敏度和通量较高，但寻找一个热稳定的抗原和研制出针对此抗原的特异性单克隆抗体难度较大。组学技术是未来发展方向，基于质谱技术的精准定性定量分析可为肉类成分的检测开辟一个新途径。肉制品加工工艺从简单到复杂的转变，进一步对肉制品真实性鉴别技术提出更高要求，预期未来可通过多组学、多技术相互融合发展。因此，发挥肉及肉制品安全检测技术的互补优势，将成为重要的技术开发的发展方向，为检测肉及肉制品真实性问题提供更为完善的技术支撑，保障肉及肉制品的安全性。