苦参碱、蛇床子素和硝唑尼特3种药物抗人五毛滴虫的作用效果

程一丹，张西臣，张洪波，李建华，宫鹏涛，王晓岑，李 新，张 楠

(吉林大学 动物医学学院/人兽共患病研究教育部重点实验室，吉林 长春 130062)

人五毛滴虫(Pentatrichomonashominis)是一种新发现的潜在人兽共患肠道原虫，临床上可引起腹泻、腹痛、食欲减退等症状[1]。人五毛滴虫感染呈世界性分布，感染宿主广，可感染人、犬、猫、非人灵长类及啮齿类动物等[1-5]。近年来ZHANG等[6]发现人五毛滴虫感染还与胃肠道癌有高度关联性。因此，防治人五毛滴虫病已经成为不容忽视的问题。

临床上对感染人五毛滴虫的患者常用口服甲硝唑[1]和替硝唑[7]的方法进行治疗，但其毒副作用较大且存在一定程度的耐药性，因此寻找高效、低毒的抗人五毛滴虫新药势在必行。目前，已有研究报道蛇床子素在体外对人五毛滴虫的杀伤作用[8]，未见硝唑尼特和苦参碱抗人五毛滴虫作用的研究报道。

本试验选用苦参碱、蛇床子素和硝唑尼特3种药物分别在体内和体外研究抗人五毛滴虫的作用效果，为寻找抗人五毛滴虫新的药物防治该病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 虫株人五毛滴虫虫株(ATCC30000)由吉林大学动物医学学院寄生虫实验室冻存。

1.2 试验动物BALB/c小鼠，3～4周龄，雌性60只，购于北京维通利华试验动物技术有限公司。

1.3 主要试剂苦参碱，购于上海源叶生物科技有限公司(纯度≥98%)，批号S31035；蛇床子素，购于上海源叶生物科技有限公司(纯度≥98%)，批号S26004；硝唑尼特，南雄阳普医疗科技有限公司(纯度≥99%)，批号210501。

1.4 人五毛滴虫滋养体的体外纯培养将冻存于液氮中的人五毛滴虫复苏，参照CHAO等[9]的方法，应用TYI-S-33培养基在37℃条件下无菌培养，待生长至对数期后进行传代培养。传代时将取1 mL 虫体加入新的培养管中，并加入新鲜培养基。

1.5 不同质量浓度苦参碱、蛇床子素和硝唑尼特对人五毛滴虫的体外杀伤作用待人五毛滴虫培养至对数生长期，将虫体浓度调整为1×106个/mL。将40 g/L苦参碱溶液(溶剂为蒸馏水)、40 g/L蛇床子素溶液(溶剂为无水乙醇)、2 g/L的硝唑尼特溶液(溶剂为DMSO)，加入虫体中，设置空白对照组和溶剂对照组。苦参碱和蛇床子素终质量浓度梯度为4.00，2.00，1.00，0.50，0.25 g/L，硝唑尼特的终质量浓度梯度分别为10.000，5.000，2.50，1.250，0.625 mg/L。在37℃培养箱中培养24 h分别对各培养管中虫体数量进行观察计数。

1.7 苦参碱、蛇床子素和硝唑尼特作用人五毛滴虫的透射电镜观察以苦参碱、蛇床子素和硝唑尼特3种药物的最适质量浓度处理10 h后收集虫体进行透射电镜样品制作，同时设立无药物对照组。离心弃上清，用PBS洗涤3次，3 500 r/min离心10 min，去上清，2.5%戊二醛固定液加入沉淀固定1 h以上。将样品送至吉林大学人兽共患病研究所电镜室，进行1%饿酸固定、脱水、超薄切片等制样步骤。待样品制备完成后置于HITACHI H-7650透射电境下进行超微结构的观察。

1.8 苦参碱、蛇床子素和硝唑尼特对人工感染人五毛滴虫小鼠的体内杀伤作用每只BALB/c小鼠经口灌服人五毛滴虫1×106个。将感染成功的BALB/c小鼠，随机分为11组，每组5只。第1～3组为硝唑尼特用药组：用药剂量分别为0.5，1.0，2.0 mg/kg；第4～6组为蛇床子素用药组：用药剂量分别为25.0，50.0，100.0 mg/kg；第7～9组为苦参碱用药组：用药剂量分别为25.0，50.0，100.0 mg/kg；第10组为感染不用药组；第11组为不感染不用药组。各组小鼠分别经口灌服相应剂量药物，每天1次，连续灌服3 d。收取各组小鼠粪便并提取粪便基因组，参考人五毛滴虫18S rRNA 基因的特异性引物[10](Ph1:5′-ATGGCGAGTGGTGGAATA-3′,Ph2:5′-CCCAA-CTACGCTAAGGATT-3′；Th3:5′-TGTAAACG-ATGCCGACAGAG-3′,Th5:5′-CAACACTGA-AGCCAATGCGAGC-3′)，应用巢式PCR扩增以检测药物对人五毛滴虫的杀伤作用。

2 结果

2.1 不同质量浓度苦参碱、蛇床子素和硝唑尼特对人五毛滴虫的体外杀伤作用培养24 h后，苦参碱、蛇床子素和硝唑尼特在不同质量浓度作用下的人五毛滴虫密度见表1，与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。3种药物均能够抑制人五毛滴虫的生长繁殖，且随着药物质量浓度的升高，对虫体生长繁殖的抑制作用也出现相应的增强。在药物作用虫体24 h后，4 g/L苦参碱和10 mg/L硝唑尼特均可完全杀灭人五毛滴虫，4 g/L蛇床子素对人五毛滴虫的杀伤作用可达到96.2%，光学显微镜下仍可看到活动虫体。

表1 不同质量浓度苦参碱、蛇床子素和硝唑尼特对人五毛滴虫的体外杀伤作用

2.2 不同作用时间苦参碱、蛇床子素和硝唑尼特对人五毛滴虫的体外杀伤作用以4 g/L苦参碱用药2 h后，50%以上的虫体失去活力，12 h可杀死全部虫体(图1A)。而4 g/L蛇床子素在作用8 h后，药物组虫体数量减少不显著，在24 h时不能杀死全部虫体(图1B)，与同质量浓度苦参碱相比，作用效果较差。10 mg/L硝唑尼特在作用18 h时，虫体全部死亡(图1C),人五毛滴虫的死亡率随着药物作用时间的延长而增加。

A.苦参碱处理组；B.蛇床子素处理组；C.硝唑尼特处理组

2.3 苦参碱、蛇床子素和硝唑尼特作用人五毛滴虫的透射电镜观察透射电镜观察发现，人五毛滴虫经4 g/L苦参碱处理后，滋养体肿胀，胞质内部分空泡化(图2A)。由4 g/L蛇床子素处理的人五毛滴虫滋养体结构完整，核膜边缘不清晰，胞质内容物稀疏，多聚核糖体解聚，粗面内质网脱颗粒(图2B)。经10 mg/L硝唑尼特处理后，人五毛滴虫滋养体胞质内空化，核膜、胞膜崩解(图2C)。而对照组虫体横切面外观结构清晰，核膜完整(图2D)。

A.苦参碱作用人五毛滴虫滋养体10 h后的形态；B.蛇床子素作用人五毛滴虫滋养体10 h后的形态；C.硝唑尼特作用人五毛滴虫滋养体10 h后的形态；D.无药物正常组人五毛滴虫滋养体。N.细胞核；G.高尔基体；H.氢化体；C.肋；RF.波动膜；AF.前鞭毛

2.4 苦参碱、蛇床子素和硝唑尼特对人工感染人五毛滴虫小鼠的体内杀伤作用经口灌服人五毛滴虫滋养体后小鼠全部感染。经硝唑尼特低剂量组0.50 mg/kg和蛇床子素低剂量组25.0 mg/kg进行处理后，仍可扩增到人五毛滴虫，粪便及肠道灌洗液镜检可见虫体。而经硝唑尼特1.0,2.0 mg/kg剂量组、蛇床子素50.0,100.0 mg/kg剂量组和苦参碱25.0,50.0,100.0 mg/kg 剂量组治疗后，PCR和镜检均未检测到人五毛滴虫。小鼠体内试验中硝唑尼特、苦参碱和蛇床子素的最低作用剂量分别为1.0，25.0,50.0 mg/kg(图3)。

M.DL2000 DNA Marker；1～3.硝唑尼特0.5，1.0，2.0 mg/kg剂量组；4～6.蛇床子素25.0，50.0，100.0 mg/kg剂量组；7～9.苦参碱25.0，50.0，100.0 mg/kg剂量组；10.感染不用药组； 11.不感染不用药组；12.阳性对照；13.阴性对照

3 讨论

目前，临床上针对毛滴虫病一般采用硝基咪唑类药物进行治疗。抗人五毛滴虫病的药物通常选用化学药物，如甲硝唑和替硝唑。连续口服5 d剂量为60 mg/kg的甲硝唑[11]或连用口服14 d剂量为30 mg/kg的替硝唑[7]可治疗猫人五毛滴虫病。但有报道显示，在人五毛滴虫感染猫的病例中，口服甲硝唑治疗效果不明显，替换药物为罗硝唑后粪便干燥恢复正常[12]，说明甲硝唑表现出耐药性的问题。因此寻找高效、低毒的抗人五毛滴虫新药势在必行。

硝唑尼特是一种新的广谱抗寄生虫药物，在人医上该药获准用于治疗幼儿和成人的贾第虫和隐孢子虫感染[13]，但并未见临床上应用硝唑尼特治疗感染人五毛滴虫患者的报道。有相关研究显示，硝唑尼特对猪三毛滴虫和阴道毛滴虫有杀灭作用[14-15]，但并没有对人五毛滴虫的抑制效果进行研究。孟莹等[16]研究发现，硝唑尼特可杀灭猪三毛滴虫，在24 h 时其最小抑制质量浓度为12.5 mg/L。本试验与其报道的作用效果类似，当硝唑尼特用药量为10 mg/L 时，在18 h可杀死全部虫体，杀虫效果显著。

近年来，中草药抗人五毛滴虫的研究取得了很大进展。据报道，5 g/L的白头翁水浸膏组作用48 h可杀灭全部人五毛滴虫[16]；黄连、鸡冠花、金莲花和青蒿在最低有效质量浓度分别为5，5，20，8 g/L时，均可杀灭人五毛滴虫[8]。以上药物对人五毛滴虫的作用效果均只进行了体外试验，但体内治疗效果如何并没有进行深入研究。本试验就中草药提取物苦参碱和蛇床子素对人五毛滴虫的体内外作用效果进行研究。

苦参碱对阴道毛滴虫和鸽毛滴虫都有着良好的抑制及杀灭作用[17-18]，但对人五毛滴虫的具体药理作用及抑杀人五毛滴虫的作用程度研究尚不明确。赵瑞等[17]报道，苦参碱用量100～400 mg/L，对阴道毛滴虫具有明显的抑杀作用。而本试验中使用的苦参碱质量浓度最小为0.25 g/L，对人五毛滴虫也有着显著的抑杀作用，虫体死亡率接近50%。体内试验中在苦参碱以25 mg/kg的剂量治疗人工感染人五毛滴虫的小鼠后，经肠道灌洗液、粪便镜检和巢式PCR扩增确定已清除小鼠体内虫体。

蛇床子作为常见中草药，成本低廉，毒性低，有着广阔的发展前景，其对鸽毛滴虫和阴道毛滴虫有很好的抑制效果[19-20]。陈海华等[19]发现蛇床子素在5 g/L时，12 h可杀灭全部鸽毛滴虫；蛇床子素对阴道毛滴虫的最低抑制质量浓度为1.12 g/L[20]。本试验研究发现，在4 g/L质量浓度的蛇床子素作用于人五毛滴虫24 h，杀虫率达到97.88%，其与李永秀等[8]的研究结果相似，其4 g/L质量浓度组蛇床子素在体外试验中并不能完全杀灭人五毛滴虫，但有显著的抑制作用。但李永秀等[8]并未进行体内试验进行验证，而在本试验的体内试验中50 mg/kg剂量的蛇床子素有着良好的治疗效果，PCR和镜检均未检测到人五毛滴虫。

本研究采用透射电镜技术对苦参碱和蛇床子素和硝唑尼特处理后的人五毛滴虫进行观察。对照组虫体横切面外观结构清晰，核膜完整，与HONIGBERG 等[21]描述的人五毛滴虫结构基本相同。而在苦参碱和蛇床子素处理后的人五毛滴虫，均表现出多聚核糖体解聚，粗面内质网脱颗粒的现象，这与闫艳等[22]所观察到白头翁体外抗阴道毛滴虫的透射电镜结果相似。表明虫体的蛋白合成可能受到影响，胞核无法维持正常功能，进一步影响虫体生长繁殖。而硝唑尼特作用后的人五毛滴虫胞质均从破损的细胞膜处溢出，与双氢青蒿素作用后的阴道毛滴虫形态相似[23]，阴道毛滴虫的细胞膜破损与双氢青蒿素作用于微丝有关，而人五毛滴虫细胞膜的破损可能与硝唑尼特作用于微丝有关。本试验为进一步深入研究苦参碱、蛇床子素和硝唑尼特防治人五毛滴虫病的临床应用提供了参考。