HPLC法测定蛇床子中蛇床子素的含量

林进生

（福建片仔癀化妆品有限公司，福建漳州，363000）

蛇床子为伞形科蛇床属植物蛇床（Cnidiummon⁃nieri（L.）Cuss.）的干燥成熟果实。传统中医认为蛇床子味辛、苦，性温，归肾经，具有燥湿祛风、杀虫止痒、温肾壮阳的作用，常用于治疗阳痿、湿痹腰痛、急性渗出性皮肤病等疾病。现代分析表明，蛇床子所含的主要化学成分为香豆素、色原酮类、苯并呋喃类等化合物，其中最为关键的活性成分为蛇床子素［1-2］。

蛇床子素又名甲氧基欧芹酚、欧芹酚甲醚，化学名称为7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素［3］，属于香豆素类化合物。蛇床子素广泛存在于伞形科植物中，是植物中呋喃香豆素的代表性物质［4］。从大量研究表明，蛇床子素及其衍生物具有降血压、抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌［5-11］等多种生物活性，对心脑血管系统、内分泌系统、免疫系统、神经系统、呼吸系统等方面的疾病都有良好的治疗效果。

本研究通过对蛇床子素高效液相色谱测定方法精密度、稳定性、重复性的考察，确定了适于蛇床子中蛇床子素测定的参数指标，并测定了不同蛇床子样品中蛇床子的素含量，以期为蛇床子和蛇床子素的研究和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

蛇床子（亳州市弘宝堂商贸有限公司）。

1.2 试剂仪器

蛇床子素对照品（分析标准品≥99.5%，阿拉丁科技有限公司）；甲醇（北京生化科技有限公司）；乙腈（北京生化科技有限公司）；乙醇（南京化学试剂有限公司）。

Waters E2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；UTP-313型电子天平（上海花潮电器有限公司）；KQ－210A型超声波清洗仪器（昆山市超声仪器有限公司）；FSJ-A03D1小型粉碎机（小熊电器股份有限公司）；RE-52AA旋转蒸发仪器（苏州赛恩斯仪器有限公司）；SHB-IIIA循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 供试品溶液的制备

采用乙醇回流法提取蛇床子中蛇床子素。准确称取100 g蛇床子药材，放入小型粉碎机粉碎。圆底烧瓶中按料液比1：15加入30%乙醇进行热回流提取，分两次提取，每次提取时间为3 h。提取后溶液放置室温后过滤，3500 r/min离心15 min离心后抽滤，得到上清液即为蛇床子提取液。将蛇床子提取液放入旋转蒸发仪器减压回收溶剂直至浸膏状态，放入真空干燥箱烘干后得到蛇床子提取物。提取物中加入适量甲醇配置成供试样品溶液，通过0.22µm有机膜过滤备用。

1.3.2 对照品溶液的制备

准确称取蛇床子素对照品2.500 mg，加甲醇定容至25 mL棕色量瓶中，摇匀，制得质量浓度为0.1 mg/mL的对照品储备液，4℃贮存备用。

1.3.3 色谱条件

色谱柱选择Aglient C18柱（250 mm×4.6 mm，5µm），流动相为甲醇-体积分数0.05%磷酸（体积比70：30）。检测波长为322 nm，流速为1.0 mL/min，进样量为10µL，柱温为30℃。

2 结果与分析

2.1 色谱条件分析

按照色谱条件，将对稀释为50µg/mL的对照品溶液和供试样品溶液分别进样分析，得图谱如图1-2所示。分析可知，在以Aglient C18柱（250 mm×4.6 mm，5µm）为色谱柱，甲醇-体积分数0.05%磷酸（体积比70：30）为流动相，流速为1.0 mL/min，进样量为20µL，柱温为30℃检，测波长为322 nm的液相色谱条件下，蛇床子素具有明显的特征性吸收峰，特征峰的出峰时间为8.355 min。供试样品溶液中的蛇床子素在此色谱条件下，实现了其它物质的分离，特征峰明显，出峰时间为8.398 min。表明该色谱条件适于蛇床子中蛇床子素的测定。

图1 对照品色谱图Fig.1 Chromatogramof reference substance

2.2 线性关系考察

将蛇床子素对照品储备液稀释成12.5、25、50、100、200µg/mL进样液，分别进行进样分析。以进样液中蛇床子素的浓度为横坐标，以特征峰的峰面积值为纵坐标绘制标准曲线，并计算出蛇床子素的线 性 回 归 方 程 为Y=4.172×104X+1.912×102，R2=0.999 6。结果表明，蛇床子素的浓度在12.5～200µg/mL范围内，其峰面积与进样液中蛇床子素浓度具有良好的线性关系。

图2 供试品色谱图Fig.2 Chromatogram of test article

2.3 精密度考察

按照色谱条件，重复6次对供试样品溶液进行进样分析，并根据特征峰峰面积，通过回归方程计算供试样品中蛇床子素的平均含量为5.12±0.04%。对测定结果进行统计分析，计算出RSD为1.28%（n=6），小于3.0%，表明该方法的精密度良好。

2.4 稳定性考察

取蛇床子供试样品品溶液，室温下放置，分别在0、2、4、6、8、10、12 h进行进样分析。通过蛇床子素的峰面积计算供试品中蛇床子素的含量，并对结果进行统计分析，计算测定结果的RSD为1.32%（n=7），小于3.0%，表明在本方法条件下，蛇床子供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.4 重复性考察

取同一蛇床子样品分成6份，分别按照试验方法提取制成供试样品溶液，按色谱条件分别进样分析，计算测定结果，并对结果进行统计分析，计算出RSD为0.87%（n=6），小于3.0%，表明其重复性良好。

2.5 加样回收率测定

分别精密吸取蛇床子素对照溶液2、2、3、3、4、4 mL，放置于20 mL容量瓶中，挥干。取6份已知含量的供试样品溶液加入容量瓶中，加入甲醇溶液稀释至刻度，分别取20µL注入高效液相色谱仪器中，按照色谱条件进行分析，根据回归方程计算蛇床子素含量，并计算加样回收率，结果见表1。

表1 蛇床子素加样回收率试验结果Table 1 Test results of recovery of osthol

由表1分析可知，该方法平均加样回收率为99.36%，加样回收的RSD为1.53%，表明该方法测定蛇床子素含量具有良好的准确度。

2.6 样品含量测定

取3批蛇床子药材制成供试品溶液，按照色谱条件进行测定，根据回归方程计算蛇床子素在蛇床子中的含量。结果见表2，所测样品中蛇床子素含量分别为5.47%、5.56%和5.71%，同批次内样品的蛇床子素含量测定值的RSD值分别为1.36%、1.52%、1.17%，表明研究所确定的测定方法对不同蛇床子样品中蛇床子素的测定均有较高的准确度。

3 讨论

蛇床子素作为植物中呋喃香豆素的代表性物质，大量研究表明其具有降血压、抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌等多种生物活性，对心脑血管系统、内分泌系统、免疫系统、神经系统、呼吸系统等方面的疾病都有良好的治疗效果。尤其是近年来的研究表明，蛇床子素对癌症、脑退化疾病都有较好疗效，这对于医学和社会都具有重大价值，随着现代科学研究的不断深入，蛇床子素将在临床上展现出更广阔的前景。

本研究通过对蛇床子素高效液相色谱测定方法精密度、稳定性、重复性的考察，确定了适于蛇床子中蛇床子素HPLC测定的条件为：以Aglient C18柱（250 mm×4.6 mm，5µm）为色谱柱，甲醇-体积分数0.05%磷酸（体积比70：30）为流动相，流速1.0 mL/min，进样量20µL，柱温30℃，检测波长为322 nm。通过该方法测定不同蛇床子样品中蛇床子素的平均含量为5.58%。