从吉林省发生先天性关节弯曲-脑积水综合征新生犊牛分离鉴定出阿卡班病毒

章 凡,古丽巴哈尔·图尔荪，常晓冉，王浴光，杨 丽，曹利利,郭昌明,郭 利，王新平*

(1.吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 130062；2.吉林大学 教育部人兽共患病研究重点实验室，吉林 长春 130062；3.人与动物共患传染病国家重点实验室，吉林 长春；4.吉林省畜牧兽医科学研究院，吉林 长春 130062； 5.吉林农业科技学院 动物科技学院，吉林 吉林市 132109)

赤羽病,又名阿卡班病,是由阿卡班病毒(Akabane virus,AKAV)引起的一种新生犊牛临床上四肢关节蜷缩弯曲,无法站立与最后死亡为特征传染病，也是国内从国外进口牛、羊必须检疫的7种疫病之一[1]。引起本病的病原体为布尼亚病毒科中的AKAV。怀孕牛、绵羊、山羊对该病毒易感,感染后能导致流产、早产、死产及先天性关节弯曲和脑积水征[2-4]。AKAV于1959年首次分离于日本群马县赤羽村的蚊子体内并命名[5],之后澳大利亚、韩国、肯尼亚、南非和以色列等国也相继分离到AKAV[6]。据报道，台湾地区于1997年从牛群中分离到AKAV[7]。国内于2010年从湖南省的蚊虫体中分离得到了AKAV[8]，之后于2012年进行的流行病学调查显示，新疆地区的牛羊群中普遍存在AKAV抗体[9]。2016年国内首次从山羊中分离出AKAV[10],但目前尚未见有从东北三省地区分离到牛源AKAV的报道。

2021年9月以来,吉林省许多地区发生了新生犊牛临床上以先天性关节弯曲和中枢神经系统异常为特征的疾病。本研究通过流行病学、病理学、病毒分离与电镜观察及分子生物学方法,确定出引起该疫病的病原体为AKAV。

1 材料与方法

1.1 流行病学调查与样品采集针对吉林省今年9月份以来多地发生的不明病因的疫病,进行了现场流行病学调查，并从长春、延边等地采集了发病犊牛的组织器官，同时现场观察、记录发病牛的临床症状。

1.2 样品处理将采集的组织以常规方法进行组织匀浆后，以12 000 r/min,4℃离心10 min。上清液以0.45 μm滤器过滤后，用于病毒的分离。

1.3 病原分离将处理的组织上清液接种单层MDBK,置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养感作2 h,弃去接种物,以Hanks缓冲液洗涤后,加入含有2%FBS的细胞培养液培养。同时，以未接毒MDBK细胞作为阴性对照。 接毒后，定时观察与记录细胞变化,待细胞病变达到70%以上时，将细胞置于-20℃反复冻融3次,12 000 r/min离心5 min,收集上清液,盲传5代后,置于-80℃保存备用。

1.4 病毒粒子的电镜观察将分离获得的病毒以2%磷钨酸负染后，进行电镜观察。

1.5 病料组织及细胞分离物中病原体的检测以常规方法提取流产犊牛组织及接毒细胞的RNA,合成cDNA后,分别以AKAV、Schmallenberg病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛疱疹1型病毒等病原体的特异性引物进行病原基因片段扩增。PCR扩增产物以1.0%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。

1.6 PCR扩增片段的及序列测定与分析PCR扩增出的基因片段直接进行序列测定或克隆到T-载体后进行序列测定。测定出的序列与GenBank序列进行比对分析。

2 结果

2.1 流行病学调查与临床及病理学检查结果对吉林省延吉某地的调查结果显示，该地共计饲养有牛只约12 000头,其中经产母牛约7 000头,品种多为西门达尔牛，占比90%左右。发病牛只多见于散在饲养农户。饲养方式和场地多种多样,包括山上和林场自由放牧、牛棚饲养等。配种多采取冷冻精液人工配种,种牛精液多来源于同一种牛,该种牛由国外引进。该地于今年9月发现首例病例,临床表现为初生牛犊部分四肢关节呈蜷缩状,无法伸直,母牛无明显症状,截至目前累计发生28例。同一母牛产出的同一批次犊牛发病情况不同。一起病例中，同生双胎犊牛1头无明显症状，1头症状明显；病例二中，母牛同时生产出1头四肢关节均呈现弯曲和1头仅1个关节发病的犊牛。该地以往养牛只无重大疾病史,没有发生大规模牛传染病的流行记录,同地羊和鹿未见有类似症状。

病理剖检可见内脏器官尤其心脏表面有多量出现斑点，脑部皮下见有明显出血斑、点，脑内有多量积液、出血，肠黏膜可见有点状出血。依据流行病学情况、临床症状与病理剖检的结果，初步确定新生犊牛发生的疫病为先天性畸形与脑水肿。

A,B.新生犊牛关节肿胀、弯曲，无法站立；C.病死犊牛病理剖检可见心脏表面有多量出现点;D.脑部皮下有出血斑、点，脑内有大量积液、出血

2.2 病原的分离与初步鉴定将处理后的组织样品接种MDBK细胞,结果从农安与延吉采集流产犊牛的组织接种细胞后均可产生规律性的细胞病变(图2)。分离获得的毒株分别命名为JL-AKA-CC21-1株、JL-AKA-CC21-2株和JL-AKA-YJ21株。

A.正常细胞对照; B～D.毒株引起的病变,可以观察到细胞聚集,后期脱落死亡(40×)

2.3 电镜观察结果将病毒分离物处理后取上清液进行负染电镜观察，结果观察到大量大小为70～130 nm的疑似为布尼亚病毒粒子 (图3)。观察到的细胞分离毒与从病死动物组织中观察的病毒一致。

图3 电子显微镜负染观察分离获得的病毒粒子(比例尺为100 nm)

2.4 PCR扩增出病毒的基因片段应用AKAV的特异性引物序列及梯度PCR扩增分离病毒株的基因组序列，结果获得预期大小的基因片段(图4)。而应用PCR对采集的流产犊牛组织样品及病毒分离株进行了Schmallenberg病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛疱疹1型病毒检测,结果未检出Schmallenberg病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛疱疹1型病毒的基因片段 (PCR结果略)。

M.DL2000 DNA Marker；1.阴性对照;2～5.部分样品的扩增结果

2.5 病毒序列的测定及分析将上述扩增出基因片段进行序列测定并与GenBank中的序列进行比对分析，结果显示分离毒株为AKAV。

3 讨论

A.AV属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)正布尼亚病毒属(Orthobunyavirus)辛波(Simbu)病毒血清群中的一个亚群,是引起牛、山羊和绵羊临床上以流产、早产、死胎及新生牛羊积水性无脑症和先天性关节弯曲为特征的虫媒病毒性传染病的病原体。动物妊娠早期感染会导致大脑和脊髓的中度至重度发育不良，妊娠后期的感染会导致脑脊髓炎。成年动物感染呈亚临床类型。

本研究针对吉林省多地区发生的临床上以先天性关节炎和中枢神经系统异常为特征的疾病,通过流行病学调查、病毒分离与电镜观察及分子生物学检测,确定出引起此次疫病的病原为AKAV。为了排除其他引起新生犊牛先天性畸形的病原体，我们应用PCR同时检测Schmallenberg病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛疱疹1型病毒，结果病死动物组织和病毒分离物中均未检测出相应病毒的基因片段，进一步确定了AKAV是引起吉林省新生犊牛先天性畸形与脑积液综合征的病原体。

病毒分离的成功与否直接决定了该病后期诊断方法的建立与疫苗的研发。本研究应用MDBK细胞成功分离出AKAV，接毒细胞产生规律的细胞病变，同时应用Vero和BHK细胞也进行了病毒的分离，结果接毒细胞呈现类似的细胞病变，该结果将为后期病毒的大规模培养与疫苗的研发提供了前提。

阿卡班病广泛分布于亚洲和非洲的热带和温带地区，在国内属于新发传染病。本课题组进行的流行病学调查中发现,延吉等地雨水降水量较高,有利于蚊虫繁殖与该病的传播,与布尼亚病毒疫情增多情况可能有关。此外，吉林省多地发生的疫情多始于今年9月份至秋冬季,有别于常规的虫媒传播疾病的传播季节,一方面可能是虫媒在夏季活跃季节感染怀孕母牛，导致9～12月出现发病；另一方面，多个地方母牛配种采取冷冻精液人工配种,且种牛精液均来源于由国外引进同一种牛,这也可能造成本病的传播。疫情是否可以通过人工授精进行传播，需要对相关人工授精站的精液进行检测和进一步的流行病学跟踪调查。

本研究从吉林省多地发生的新生犊牛先天性关节弯曲-脑积水征病例中检测出AKAV，确定出该病毒是新生犊牛先天性关节畸形和中枢神经系统畸形的潜在病原体,为吉林省预防和控制该疾病提供了依据。