鹅源星状病毒TaqMan探针和SYBR Green Ⅰ染料法荧光定量PCR检测方法的建立及其应用比较

邓昕竹,余 群，朱盈名，赵自亮，陆 婧，赵光伟,，张立武，程方俊*，杨晓伟,*

(1.西南大学 动物医学学院，重庆 荣昌 402460；2.重庆三杰众鑫生物工程有限公司，重庆 荣昌 402460)

近年来，我国养鹅场不断发生一种以痛风症为主要特征的疾病，主要表现为采食量下降、精神沉郁、拉石灰样稀便、脱水、消瘦、瘫痪，剖检可见肾肿大斑驳、肾脏输尿管有白色尿酸盐沉积、内脏器官和关节等处有白色尿酸盐附着或沉积，临床称鹅“痛风病”[1]。该病多发8～19日龄雏鹅，一旦感染，全群发病率80%以上，病死率23.6%～78.6%，朗德鹅和国内地方品种如马岗鹅、四川白鹅、皖西白鹅、狮头鹅、籽鹅、五龙鹅、泰州鹅等均易感[2-4]。研究人员综合分析认为饲料蛋白含量高、钙磷比例失调不是导致该病暴发流行的主要原因，经病原分离鉴定、宏基因组测序及动物回归试验，证实该病由鹅源星状病毒(goose astrovirus，GoAstV)引起[5-6]。

星状病毒(astrovirus，AstV)是广泛存在于人、多种哺乳动物和鸟类的一种RNA病毒。圆形、无囊膜，是单股正链RNA病毒，直径为25～35 nm，属于星状病毒科[7-8]，因在电子显微镜下，病毒表面有5～6个突起，结构呈星形，故称之为星状病毒[9]。全基因组长度为6.1～7.9 kb，含有3个开放阅读框ORF1a、ORF1b和ORF2。根据其感染宿主的不同而划分为2个病毒属：哺乳动物星状病毒属和禽星状病毒属[10]。因为ORF1a 3′端基因片段为了适应新宿主的插入或缺失[11]，AstV ORF1a、ORF1b和ORF2具有长度多样性。AstV ORF1a和ORF1b阅读框之间存在重叠区域，哺乳动物AstV重叠区域为10～148 nt，而禽AstV重叠区域为12～45 nt，同时重叠区包含1个对下游RNA依赖性RNA聚合酶的翻译重要的核糖体移码信号[12]。在不同种的AstV之间ORF1b基因长度差异最小，并且其编码的RNA依赖性RNA聚合酶蛋白在AstV蛋白中最保守；ORF2其内部基因高度变异，常出现基因突变现象，在3个ORFs中具有最大的变异性；AstV基因分型主要依据ORF2的核酸序列演化分析[13-14]。

目前针对GoAstV的检测方法主要是普通RT-PCR方法，但与荧光定量PCR方法相比，其敏感性较低，因而为建立一种灵敏度更高、特异性更强、重复性更好的临床检测手段，本试验针对GoAstV的保守基因设计引物和荧光探针，分别建立基于TaqMan探针和SYBR Green Ⅰ染料的荧光定量PCR检测方法，并比较两者的检测效果，为GoAstV的诊断和流行病学调查提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 病毒与临床病料GoAstV，小鹅瘟病毒(GPV)，鹅副黏病毒(GPMV)，鸭呼肠孤病毒(NDRV)，鸭圆环病毒(DuCV)，鸭肝炎病毒Ⅰ、Ⅲ型(DHV-1、DHV-3)和腺病毒Ⅱ型(DAdV-2)等病毒均由本实验室分离鉴定并保存。临床样本来自2020年6月至2021年6月期间山东、四川、重庆等鹅场送检的病料，实验室-40℃保存。

1.2 主要试剂RNAiso Plus、rTaq Mix、琼脂糖、溴化乙锭(EtBr EB)、DNA Marker(2000/5000)、Probe qPCR Mix、TB Green Premix Ex TaqⅡ购自TaKaRa公司；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；pBLUE-T快速克隆、DH5α感受态细胞购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。

1.3 引物和探针基于GoAstV OFR1b的基因保守区域，利用软件Primer 5.0设计1对TaqMan荧光引物Q1-F：ATTGACACAAGCCTATCATC-GC，Q1-R：CTGGCTCACCCATTTTGAGATAG，及探针5′-FAM-TGAGCGTCGGCAATGACCCA-TGCTGT-MGB-3′，扩增目的片段大小为123 bp。1对SYBR GreenⅠ荧光引物Q2-F：TTATCCCTGAGTAATCTGA，Q2-R：GGAAATCCAAGTGGC，扩增目的片段大小为134 bp；1对普通RT-PCR引物GAstV-F：5′-GATTGGACCCGTTATGAT-3′，GAstV-R：5′-TTTGACCCACATACCA-AA-3′，扩增目的片段大小为434 bp。均由华大基因有限公司合成。

1.4 病毒核酸的提取及反转录将储存于-80℃的GoAstV尿囊液按照RNAiso Plus说明书提取RNA，于-80℃保存；按照TaKaRa反转录试剂盒说明书操作得到病毒cDNA，于-20℃保存。

1.5 重组质粒标准品的建立以获取的cDNA为模板，和引物GAstV-F/R进行PCR扩增，反应体系：rTaq Mix 12.5 μL、上下游引物各1.0 μL、cDNA模板2.0 μL，ddH2O补足25 μL。反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，48℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸7 min，最后4℃保存。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。用胶回收试剂盒回收并纯化目的片段，使用pBLUE-T快速克隆试剂盒进行纯化产物的连接，转化进大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，接入含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养12 h，用质粒提取试剂盒提取重组质粒，送华大基因有限公司测序。将测序鉴定正确的阳性质粒命名pBLUE-T-GoAstV，采用超微量分光光度计测定标准品浓度，根据公式：(6.02×1023copies/mol)×DNA量(g)/[DNA长度(碱基数)×660 g/(mol·碱基)]=拷贝数，计算标准品拷贝数。利用ddH2O将质粒标准品pBLUE-T-GastV连续10倍梯度稀释至10-10，将其作为模板按照已优化的条件进行荧光定量PCR检测。

1.6 荧光定量PCR方法的建立与优化

1.6.1TaqMan探针法荧光定量PCR方法的建立 反应体系为20 μL，其中Probe qPCR Mix 10 μL，特异性探针2 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，ddH2O补足20 μL。反应条件：95℃ 1 min，95℃ 10 s、60℃ 30 s共40个循环。用单一变量法对反应体系中上下游引物、特异性探针的浓度以及反应条件依次进行优化。

1.6.2SYBR Green Ⅰ染料法荧光定量PCR方法的建立 反应体系为20 μL，其中TB Green Premix Ex TaqⅡ10 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，ddH2O补足20 μL。反应条件：95℃ 1 min，95℃ 5 s、60℃ 30 s共40个循环。用单一变量法对反应体系中上下游引物的浓度和反应条件依次进行优化。

1.7 探针法和染料法荧光定量PCR的比较以倍比稀释的标准品质粒作为模板，对本试验建立并优化的2种荧光定量PCR检测方法进行特异性、敏感性和重复性的验证及比较。

1.7.1特异性试验 用病毒RNA提取试剂盒提取GoAstV、NDRV、DHV-1和DHV-3基因组RNA，反转录合成cDNA；用病毒DNA试剂盒提取GPV、GPMV、DadV-2和DuCV的基因组DNA。应用本试验已经建立优化的2种荧光定量PCR方法进行扩增，同时设置阴性对照，验证并比较2种方法的特异性。

1.7.2敏感性试验 以稀释浓度2.5×106～2.5×100copies/μL的质粒为模板进行敏感性检测，以Ct < 35且出现标准的“S”型扩增曲线的最低浓度作为2种方法的检测灵敏度。

1.7.3重复性试验 每个稀释度设置3个重复孔进行重复性试验，通过计算重复性试验中Ct值的变异系数来进行检测方法的稳定性的评估和比较。

1.8 临床样品的检测收集临床上疑似GoAstV的雏鹅痛风的病料，分别用本试验建立的TaqMan荧光定量PCR方法、SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和普通RT-PCR方法进行检测，并比较其检出率。

2 结果

2.1 标准品的鉴定结果以GoAstV和重组质粒pBLUE-T-GoAstV分别为模板，用引物GastV-F/R进行常规PCR反应，PCR扩增产物约为430 bp，产物大小与预期片段大小一致。

M.DL2000 DNA Marker；1.GoAstV阳性样品；2.重组质粒pBLUE-T-GoAstV；3.阴性对照

2.2 阳性标准质粒浓度测定及拷贝数计算通过核酸蛋白检测仪测定阳性标准质粒的质量浓度的平均值为94 mg/L，利用拷贝数计算公式将该结果换算为拷贝数，最终计算得到构建的阳性标准质粒的拷贝数为2.5×1010copies/μL。

2.3 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR溶解曲线重组质粒pBLUE-T-GoAstV经SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法扩增，溶解曲线结果显示，扩增产物在82℃左右均出现单一波峰(图2)，无引物二聚体和非特异扩增峰。

1.GoAstV；2.阴性对照

2.4 反应体系及反应程序的优化TaqMan探针法：反应体系为20 μL，其中Premix Ex Taq 10 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，探针0.4 μL，用ddH2O补足至20 μL。最终反应条件为95℃ 1 min， 95℃ 5 s、60℃ 31 s共40个循环。

SYBR GreenⅠ荧光定量PCR：反应体系为20 μL，其中TB Green Premix Ex TaqⅡ10 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，用ddH2O补足至20 μL。最终反应条件为94℃ 1 min，94℃ 5 s、55℃ 31 s共40个循环。

2.5 标准曲线的绘制以2.5×102～2.5×108copies/μL的标准质粒为模板分别用TaqMan荧光定量PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法进行定量检测，以读取的Ct值为y轴，以标准质粒浓度为x轴绘制标准曲线。分析获得TaqMan荧光定量PCR方法扩增相关系数R2为0.999，标准曲线的方程为y=-3.026x+37.331(图3A)；SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增相关系数R2为0.999，标准曲线的方程为y=-3.407x+39.848(图3B)。结果表明，2种荧光定量PCR方法建立的标准曲线都能够准确地反映目的基因的扩增。

A.探针法标准曲线；B.染料法标准曲线

2.6 特异性试验用所建立并优化的2种荧光定量PCR方法对GPV、GPMV、NDRV、DuCV、DHV-1、DHV-3、DAdV-2和GoAstV的cDNA进行检测，结果显示2种荧光定量PCR方法均仅对GoAstV有特异性扩增，其他病原及阴性对照均无特异性扩增，特异性良好(图4)。

A.TaqMan探针法；B.SYBR GreenⅠ染料法。1.GoAstV；2～8.GPV、GPMV、NDRV、DuCV、DHV-1、DHV-3、DAdV-2；9.阴性对照

2.7 敏感性试验以2.5×100～2.5×106copies/μL 10×倍比稀释的重组质粒pBLUE-T-GoAstV为模板，用本试验建立优化的2种荧光定量PCR方法和普通RT-PCR方法分别进行检测。TaqMan荧光定量PCR方法的最低检测浓度为2.5×101copies/μL(图5A)，SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的最低检测浓度为2.5×102copies/μL(图5B)，普通RT-PCR方法的最低检测浓度为2.5×103copies/μL(图5C)。结果表明：本试验建立的TaqMan和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法分别比普通RT-PCR方法的灵敏度高100倍和10倍；TaqMan法比SYBR GreenⅠ染料法灵敏度高10倍，说明TaqMan探针法荧光定量PCR方法的灵敏性更高。

A.TaqMan探针法;B.SYBR Green Ⅰ染料法(1～6.2.5×106 ～2.5×101 copies/μL的标准质粒；7.2.5×100 copies/μL的标准质粒)；C.普通RT-PCR(M.DL2000 DNA Marker；1～4.2.5×106 ～2.5×103 copies/μL的标准质粒；5～7.2.5×102 ～2.5×100 copies/μL的标准质粒)

2.8 重复性试验TaqMan荧光定量PCR：以5个稀释度的重组质粒pBLUE-T-GoAstV为模板分别进行组内和组间重复性试验，结果显示组内Ct值变异系数(CV)为0.18%～0.70%，组间Ct值CV为0.17%～1.28%，均小于1.5%(表2)，表明该方法具有良好的可重复性。

表1 TaqMan探针法荧光定量PCR重复性检测结果

表2 SYBR GreenⅠ染料法荧光定量PCR重复性检测结果

SYBR GreenⅠ荧光定量PCR：以5个稀释度的重组质粒pBLUE-T-GoAstV为模板分别进行组内和组间重复性试验，结果显示组内Ct值CV为0.50%～1.85%，组间Ct值CV为1.19%～2.49%，均不超过2.50%(表3)，表明该方法也具有良好的可重复性。

对比2种方法，结果显示TaqMan荧光定量PCR方法的组内变异系数和组间变异系数均小于SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR的组内变异系数和组间变异系数，说明TaqMan荧光定量PCR方法重复性更好，更加稳定。

2.9 临床样品的检测分别用本试验建立的TaqMan荧光定量PCR方法、SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法和普通RT-PCR方法对临床上71份样品进行检测，TaqMan荧光定量PCR方法检测出阳性35例，检出率为49.30%；SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法检测出阳性30例，检出率为42.25%；普通RT-PCR方法检测出阳性21例，检出率为29.58%。结果显示TaqMan荧光定量PCR方法的检出率最高，与敏感性试验结果相一致。

3 讨论

A.tV的全基因组包含1个5′-非翻译区(UTR)，3个开放的阅读框(ORFs)，3′-UTR和poly(a)尾巴[15]。ORF1编码非结构蛋白，ORF2编码病毒粒子衣壳蛋白(Cap)，比较两者ORF1更为保守。星状病毒科病毒ORF1a、ORF1b蛋白通常含有某些具有特殊功能的保守氨基酸基序，编码星状病毒非结构蛋白，其中包括RNA依赖性RNA聚合酶[16]。ORF1b阅读框内RdRp结构域内含有4个保守基序，并包含有AstV保守的RNA聚合酶基序[17]；蒲露莎[18]分离鉴定的GoAstV的2株分离株在ORF1b中没有发生氨基酸的突变；张玉杰等[19]分离鉴定的GoAstV的2株分离株分别与GenBank上已发表的星状病毒在ORF1a、ORF1b和ORF2所编码氨基酸序列进行比对分析，ORF1b氨基酸序列相似性均为最高；这些数据均表明，ORF1b序列高度保守，因此本试验在ORF1b内选取434 bp的片段作为检测的靶标，能够保证本方法的准确性。

电子显微镜是最初应用于诊断AstV的病原学诊断方法，却不适用于大量的临床检测，而GoAstV不产生凝血反应，导致一些血清学诊断方法不能应用。目前，临床上检测GoAstV的方法还是以普通RT-PCR为主，而该方法虽然操作简易但耗时长、敏感性弱且需要凝胶电泳，不利于临床上快速诊断病原；张玉霞等[20]建立了环介导等温扩增技术(LAMP)检测方法对GoAstV进行检测，该方法能在恒温条件下快速扩增核酸。但LAMP和普通RT-PCR一样，只能做定性分析，不能准确定量。实时荧光定量PCR作为近年来迅速发展起来的一种新兴检测技术，通过采集PCR反应体系中的荧光信号实时检测每一个循环扩增产物量的变化，最终通过Ct值和标准曲线对起始模板进行精确的定量分析。与传统PCR方法相比：它的敏感性、自动化程度更高，耗时短，能够实现实时监控，既能定性又能定量，操作简单；所以本试验采用了荧光定量的检测方法。

实时荧光定量PCR收集的荧光信号来源主要是荧光探针和荧光染料，分为探针法与染料法。TaqMan探针法通过将标记有荧光素的探针引物加入模板DNA，反应中切断TaqMan探针，荧光素游离于反应体系中，特定光激发荧光，从而使荧光监测系统可接收到荧光信号，实现荧光信号的累积同步于PCR产物的形成。TaqMan-MGB标记技术在传统TaqMan探针的基础上，用MGB基团修饰3′末端非荧光淬灭基团，在不增加探针碱基数的条件下，将探针的温度值提高至少10℃，特异性提高并且容易设计[21]。此外，TaqMan-MGB的3′末端标记有非荧光淬灭基团，可减少荧光背景并提高信噪比，特异性引物对和特异性探针序列可双重保障反应的特异性。SYBR Green Ⅰ染料法使用过量的荧光染料SYBR，荧光染料SYBR与DNA双链结合发射荧光信号，而不与双链结合的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，以保证荧光信号的增加同步于PCR产物的增加。有研究选取了GoAstV的ORF1a基因[23]或ORF2基因[24-25,17]建立GoAstV的荧光定量PCR检测方法，本试验选取GoAstV更为保守的ORF1b基因保守序列片段，分别建立了TaqMan荧光定量PCR方法和SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法，通过单一变量法优化条件，分别建立了2种方法的最佳条件。研究也对2种荧光定量方法进行了特异性、敏感性和重复性的验证，并从这几个方面比较2种方法的优劣。特异性试验结果显示2种方法均能特异性检测出GoAstV，对GPV、GPMV、NDRV、DuCV、DHV-1、DHV-3和DAdV-2这些常见病毒检测均呈阴性，说明2种方法均有良好的特异性；敏感性试验结果显示，TaqMan荧光定量PCR方法的最低检测浓度为2.5×101copies/μL，SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的最低检测浓度为2.5×102copies/μL，说明2种方法均有较好的敏感性。但通过比较发现，TaqMan荧光定量PCR方法比SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法敏感10倍，具有更好的灵敏度，能更灵敏地检测出低浓度病毒样品；重复性试验结果显示，TaqMan荧光定量PCR方法组内与组间变异系数均小于1.5%，SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法组内与组间变异系数均小于2.5%，说明2种方法均有良好的重复性，方法稳定性高，检出结果具有可靠性。对临床样本的检测结果显示2种方法对普通RT-PCR检测结果阳性的样品检测结果也均为阳性，且TaqMan荧光定量PCR方法的阳性检出率要高，符合本试验的验证结果。

本试验成功建立了基于GoAstV保守基因ORF1b的TaqMan和SYBR GreenⅠ的实时荧光定量PCR方法，2种方法都具有良好的特异性、敏感性和重复性；相比之下，TaqMan探针法灵敏度更高。2种荧光定量PCR方法均可应用于GoAstV的临床检测和分子流行病学调查。