脱苦荷叶茶发酵菌种筛选及工艺优化

林 媛，邱松林

(1.福建生物工程职业技术学院， 福建 福州 350007;2.厦门海洋职业技术学院， 福建 厦门 361012)

荷叶为睡莲科莲属植物莲NelumbonuciferaGaertn的叶片，其味苦、性平，具有减肥、抗氧化、抗肿瘤、清热解暑等功效[1]。国内外研究表明，荷叶中含有多种功效成分，包括黄酮、生物碱、有机酸以及挥发油[2-4]等，在我国卫生部监发的(2002)第51号文件中，荷叶被列入“既是食品又是药品”的名单中，其在食药两方面均广泛的应用前景。但因荷叶中含有槲皮素[5]和单宁[4]等苦涩味物质，目前荷叶饮料常用β-环状糊精、蜂蜜和白砂糖等[6-8]作为苦涩味的掩盖剂，其效果并不令人满意，因此市面上少有荷叶饮料类产品。

食用菌发酵茶是将食(药)用真菌接种至茶叶或其他食(药)用植物制成的培养基上，在发酵过程中，通过优化培养基配比，可以获得具有较高保健价值的新型食用菌发酵茶，通过发酵过程的代谢作用使茶叶或叶片发生深度的良性生理生化变化，从而改善茶叶的口感和品质[9]。灵芝Ganodermalucidum又名灵芝草、丹芝、仙草等，它含有活性肽、多糖、碱基、核酸以及人体所必需的多种微量元素、酶和生物碱等生物活性物质[10-11]；现代医学研究证明，灵芝具有提高人体免疫力、辅助调节血压血脂、强化造血功能、防癌抗癌、镇痛和延缓细胞衰老等功能[12-14]。猴头菇Hericiumerinaceus是齿菌科、猴头菇属真菌[15]，国外研究发现，猴头菇含有多种人体必需的营养元素、丰富的多酚和黄酮类物质[16-17]，具有清除自由基[18]、消炎[19]、抗菌[20-21]和杀死癌细胞[13]等作用，可用于治疗消化不良、胃炎、胃溃疡等消化系统疾病。金针菇Flammulinavelutipes又名金菇、智力菇等，含有丰富的多糖、蛋白质及多种微量元素，营养价值高[22]，现代医学研究表明，金针菇多糖是其主要的功能物质，具有保肝、护肝、抗肿瘤和改善记忆力等功能活性[23-24]。夏丽飞等[25]研究发现，粗老晒青茶经白参菌发酵后，色泽、香气和滋味等品质均明显提高；杨茜茜[26]从9株灵芝菌种中筛选最适宜雪梨发酵菌种，结果发现鹿角灵芝能显著提高雪梨汁的品质，是雪梨汁发酵的最适菌种；杨金凤等[27]以秀珍菇、香菇、雪玉松茸和灵芝4种食用菌作为酸枣叶茶的发酵菌种，研究结果表明发酵能够有效地改善茶的组分, 改变茶的口感，其中灵芝为酸枣叶发酵茶的最佳菌种。本试验选用灵芝、猴头菇和金针菇作为荷叶茶发酵的菌种，通过对比菌丝生长速度，以及发酵后苦涩味物质槲皮素含量和单宁含量的变化，选出最适于脱苦荷叶茶发酵的菌种，为荷叶发酵茶的深加工提供方法和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

灵芝、猴头菇和金针菇菌种(福建农林大学菌草研究所)；荷叶(福建建莲生物科技有限公司)；槲皮素、单宁标准品(酷尔化学科技北京有限公司)；甲醇、Folin-Denis显色剂、Na2CO3溶液(分析纯、市售)等。

1.2 主要仪器与设备

Essentia LC-16高效液相色谱仪(岛津仪器苏州有限公司)、752型紫外分光光度计(上海奥普勒仪器有限公司)、DW-86L58超低温冰箱(浙江和利超低温技术有限公司)、SJIA-5FE真空冷冻干燥箱(宁波市双嘉仪器有限公司)、SP150生化培养箱(上海精宏实验设备有限公司)、FS-UC2030GL超声萃取器(杭州泛索能超声科技有限公司)等。

1.3 试验方法

1.3.1工艺流程 荷叶茶制作工艺流程见图1。

图1 荷叶茶制工艺流程

1.3.2菌种的活化与培养 分别取灵芝、猴头菇和金针菇3种菌种母种0.5 cm2接种到PDA斜面培养基上，培养温度为(28±1)℃，时间为8～10 d，菌丝长满培养基即完成活化培养；将活化斜面菌种用10 mL无菌水冲洗，再接种至150 mL液体培养基中，在28℃恒温旋转式摇床中培养，振荡频率为150 r·min-1，待菌丝长满培养基时停止培养, 得到液体菌种。

1.3.3荷叶茶的预处理 参照陈秋香等[28]的方法，将新鲜荷叶经切碎、杀青、碾磨和干燥等工序制成荷叶茶；将干燥荷叶茶和蒸馏水按2∶1的比例充分混合，静置30 min，待荷叶茶充分吸水后，称取60 g装入宽口瓶中，用高压蒸汽灭菌后冷却备用。

1.3.4发酵菌种的筛选 取灵芝、猴头菌和金针菇发酵液各10 mL分别接入预处理的荷叶茶中，每个菌种做3个重复组，在温度为(28±1)℃的培养箱中培养，每天同一时间测量菌丝生长的长度，数值精确到0.01 cm，待菌丝长满宽口瓶后，参照刘雅颀等[29]的方法测量单宁和槲皮素的含量，通过对比菌丝的生长速度和荷叶茶中苦涩味代表物质(单宁和槲皮素)含量的下降程度，来筛选荷叶发酵茶的最适发酵菌种。

1.3.5荷叶茶发酵工艺优化 荷叶发酵茶添加了发酵菌种后，不同发酵工艺对其品质产生较大的影响，本试验通过设置不同添加量、发酵时间和温度来发酵菌种，并通过正交试验得出荷叶发酵茶的最佳发酵工艺。荷叶发酵茶的因素与水平表见表1。

表1 荷叶茶发酵工艺因素与水平

1.3.6荷叶茶感官差别评价 将制好的荷叶发酵茶与市售的荷叶茶通过差别试验方法中的选择试验法进行感官检验，从3个或3个以上的产品当中选择最喜欢或最不喜欢的样品，经过试验、计算、统计分析得出样品之间是否有差别。

2 结果与分析

2.1 不同菌种对荷叶茶发酵的影响

2.1.1不同菌种对荷叶茶发酵速度的影响 由图2可知，灵芝菌丝在荷叶茶中的生长速度最快，显著优于其他菌种菌丝的生长速度。 其中第5 d时，灵芝菌丝长度比刚接种时增加了8.03 cm，猴头菇菌丝增加了3.12 cm，金针菇菌丝此时未见增长；灵芝菌丝增长速度与其他两种菌丝达到极显著差异(P<0.01)。在第8 d时，灵芝菌丝已长满宽口瓶；猴头菇和金针菇菌丝在11 d时，长满宽口瓶。

图2 不同菌种菌丝生长情况

2.1.2不同菌种对荷叶茶中槲皮素和单宁含量的影响 由图3可知，荷叶茶槲皮素和单宁的初始含量分别为4.90‰和为7.43%，经过3种菌种的发酵，其槲皮素的含量均有降低，单宁的含量均显著降低；说明经过发酵，菌种在生长过程中，消耗了部分槲皮素，同时降解了单宁，从而使荷叶发酵茶脱苦除涩的效果较为明显。其中，经过灵芝发酵的荷叶茶，其槲皮素和单宁的含量分别降低了18.37%(P<0.05)和79.54%(P<0.01)，说明灵芝菌丝对荷叶发酵茶的脱苦除涩效果最为明显。综合3种菌丝在荷叶茶中的生长速度，确认灵芝为荷叶茶的最适合发酵菌种。

图3 不同菌种对荷叶茶中槲皮素和单宁含量的影响

2.2 荷叶茶发酵工艺的优化

由表2可知，在发酵过程中，接种量和发酵时间对荷叶茶槲皮素和单宁的含量都有较大的影响；而发酵温度在一定范围之内，对槲皮素和单宁含量的影响均较小。其中，接种量对槲皮素和单宁含量的影响最大，这说明菌丝生长过程中分解了这两种苦涩味物质；当接种量达到15.0 mL时，发酵荷叶茶中槲皮素和单宁含量最低。当发酵时间为8 d时，槲皮素和单宁含量达到最低值。发酵温度为(28±1)℃时，槲皮素含量最低，发酵温度为(26±1)℃和(28±1)℃时，单宁含量均为最低，两者间无显著差异(P>0.05)。因此，灵芝发酵荷叶茶的最佳工艺为接种量15.0 mL、发酵时间为8 d、发酵温度为(28±1)℃。

表2 荷叶茶发酵工艺正交试验分析

2.3 荷叶茶的差别试验

将制得荷叶发酵茶A与市售的其他两种荷叶茶X和Y通过差别试验方法中的选择试验法进行比较[30]。邀请50位感官品鉴员对3种产品进行感官鉴别，每位感官品鉴员选出1个自己认为最好的荷叶茶，经过数学统计分析后，从而判定本试验的荷叶发酵茶的感官效果。

评价结果为：认为本试验发酵茶产品A感官最好的人数为31人，认为市售荷叶茶X感官最好的人数为11人，认为市售荷叶茶Y感官最好的人数为8人，合计50份试验结果。

判断3种荷叶茶有无显著性差别，采用选择试验法进行差别试验后进行数学统计分析，用公式求其计算值：

其中：m为样品种数，n为有效评价数，xi为品鉴中最喜欢某个样品的人数。

本试验中n=50,m=3,x1=31,x2=11,x3=8将其代入公式可得：

自由度f=m-1=2，α=1%

查x2分布表[30]知：x2(3,1%)=11.34

从统计分析数据可以得出，本试验结论为当α=1%，3种商品存在显著性差异。即当α=1%，用本试验方法制作的发酵荷叶茶与市售的荷叶茶有显著性差别，且喜欢本试验产品的人数最多。

3 讨论与结论

采用灵芝、猴头菇和金针菇3种菌种对荷叶茶进行脱苦除涩发酵，经对比发现，灵芝菌丝在荷叶茶中的生长速度最快(P<0.05)，苦涩物质槲皮素和单宁含量下降最为显著(P<0.05)，因此，选择灵芝菌丝作为荷叶茶发酵的最佳菌丝。设置不同菌丝添加量、发酵时间和发酵温度来进行荷叶茶发酵工艺正交试验，结果表明，随着发酵时间的延长，接种量的增大，槲皮素的含量也逐渐降低；其可能原因是在菌丝接种后，随着发酵的进行，一方面灵芝菌丝生长过程中不断消耗槲皮素这类黄酮类物质，另一方面，槲皮素含有酚羟基，也会自行氧化使含量降低，这与杨金凤[27]等的研究结果一致；同时，随着发酵的进行，单宁含量也明显下降，其原因可能有3个：第一，被菌丝作为底物部分分解；第二，单宁属于酚类化合物，酚类易与糖产生化学反应，使其含量进一步降低；第三，单宁氧化产生多种分解产物，这与红葡萄酒中单宁分解产物一样，可以丰富荷叶茶的口感和层次。将制得的荷叶发酵茶与市售两种荷叶茶采用选择法进行差别试验，结果表明，制得的荷叶发酵茶在口感上显著优于市售荷叶茶(α=1%)。因此确定荷叶发酵茶的最佳工艺为灵芝菌丝接种量15.0 mL，发酵时间8 d，发酵温度(28±1)℃。