紫苏不同组织中内生芽胞杆菌的多样性与分布特性研究

林 霞，陈 峥，刘 波*，陈梅春，林恩泉

(1.福建农林大学金山学院， 福建 福州 350002； 2福建省农业科学院农业生物资源研究所， 福建 福州 350003)

植物内生菌Endophytes指与植物达到共生、寄生、腐生等关系，且在植物的整个生命过程中无明显负面影响的一类微生物[1]。内生菌在植物中普遍地分布[2]，并几乎存在于植物的所有组织中[3]。植物内生菌作为一种新的微生物资源，具有增加宿主对环境应激耐受性、促进宿主植物的生长和活性成分合成等作用，具有广阔的开发应用前景[2]。

紫苏Perillafrutescens是我国传统重要的药用、食用和油料作物[4-5]，也是卫生部首批公布的药食兼用植物之一。该植物具有抑菌、抗敏和抗氧化等重要生物特性，广泛应用在医学、食品与农业等领域，紫苏能防治感冒咳嗽，具有增强机体免疫和抑制癌症发生等功效[6-7]，在食品上用作天然防腐剂[8]等。目前关于紫苏的有效成分、药理、药效的研究报道较多，对紫苏内生菌的研究主要集中在内生真菌及其化学成分等[9-10]方面，如紫苏内生真菌Aspergillussp.12Y03[9]与Penicilliumsp.12Y25[10]。而国内外尚少见有关紫苏内生细菌的报道。

为了解紫苏内生芽胞杆菌的多样性和分布特性，本研究采用可培养法从紫苏根、茎、叶中分离内生芽胞杆菌，运用16S rRNA基因序列进行同源性比对，采用多样性指数与聚类分析进行统计，研究紫苏内生芽胞杆菌的系统发育，探讨芽胞杆菌种类分布特征与宿主植物的相关性，为植物-微生物的相互作用提供理论基础和科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1供试植物 新鲜健康的紫苏于2022年3月采集自浙江衢州。采集时保持整棵植株的完整性，带回实验室后尽快处理。

1.1.2培养基 固体培养基、液体培养基均采用LB培养基。

1.2 试验方法

1.2.1紫苏内生芽胞杆菌的分离 内生细菌的分离参考郑榕等[11]的方法，紫苏植株去除泥沙杂质后，用无菌水冲洗后，分别称取紫苏根部、茎部和叶部各1 g，用75%乙醇与1%次氯酸钠处理后，以无菌水冲洗3次，最后1次的冲洗液涂板检验植株表面是否消毒彻底。将漂洗后植物组织样本研磨后取1 mL汁液，于超净台中将样品用无菌水稀释为原来的10-1浓度，在80℃的水浴锅中加热10 min后，稀释至10-2、10-3、10-4，取不同浓度0.1 mL的样品涂布在LB平板上，每个梯度重复3次，30℃恒温箱内培养2 d。挑取形态不同的菌落进行划线、纯化、培养，获得的单菌落用-80℃甘油冷冻保藏。

1.2.2紫苏内生芽胞杆菌DNA提取和16S rRNA基因扩增 芽胞杆菌的DNA提取采用酚氯仿法提取，采用16S rRNA基因通用引物27F:5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 和1492R:5-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3，进行PCR扩增，PCR反应程序参照郑雪芳等[12]的方法，PCR产物送至铂尚生物技术(上海)有限公司测序。

1.2.3紫苏内生芽胞杆菌16S RRNA基因系统发育树的构建 将紫苏内生芽胞杆菌的16S rRNA基因序列上传至EzBioCloud，与已知模式菌株的序列进行序列同源性比对，初步判断菌株的分类地位。基因系统发育树的构建参考刘国红等[13]的方法，运用MEGA 7软件分析序列，采用Neighbor-Joining方法推断进化史，进化距离借助p-distance发进行计算。

2 结果与分析

2.1 紫苏内生细菌的分离

对紫苏根、茎、叶中的内生菌进行分离，根据菌落形态挑取单菌落进行纯化，共分离到内生细菌19株，菌株编号见表1。从紫苏根部中分离到的菌株数量最多，为11株(编号为FJAT-55199～55209)，从茎、叶中分离到的菌株数量较少，均为4株，茎部的内生菌编号为FJAT-55210～55213，叶部内生菌编号为FJAT-55214～55217。

表1 紫苏不同组织样本中分离的内生细菌

2.2 紫苏内生芽胞杆菌的16S rRNA鉴定

分离到的19株内生细菌16S rRNA基因测序鉴定结果见表2，分离菌株归属于芽胞杆菌科Bacillaceae的4个属，分别为虚构芽胞杆菌属Fictibacillus、芽胞杆菌属Bacillus、普里斯特氏菌属Priestia和Niallia。其中，虚构芽胞杆菌属Fictibacillus有2个种，为奇异虚构芽胞杆菌Fictibacillusbarbaricus、国化室虚构芽胞杆菌Fictibacillusenclensis；芽胞杆菌属Bacillus有6个种，分别为高地芽胞杆菌Bacillusaltitudinis、假蕈状芽胞杆菌Bacilluspseudomycoides、贝莱斯芽胞杆菌Bacillusvelezensis、沙福芽胞杆菌Bacillussafensis、蜡样芽胞杆菌Bacilluscereus、副蕈状芽胞杆菌Bacillusparamycoides；Niallia有1个种，为环状芽胞杆菌Nialliacirculans；普里斯特氏菌属Priestia有2个种，为阿氏普利斯特菌Priestiaaryabhattai、巨大普利斯特菌Priestiamegaterium。

表2 基于16S rRNA基因的芽胞杆菌种类鉴定

2.3 紫苏内生芽胞杆菌的系统发育分析

以19株紫苏内生芽胞杆菌及13株同源菌株的16S rRNA序列为样本，采用Neighbour-Joining方法，构建紫苏内生芽胞杆菌的系统发育树(图1)。结果表明，紫苏内生菌主要分为A、B、C、D 4个类群。类群A主要包括了6株菌(FJAT-55200、FJAT-55204、FJAT-55205、FJAT-55207、FJAT-55208、FJAT-55216)，其中5株分离自根部，1株分离自叶部，与Niallia和普里斯特氏菌属Priestia的亲缘关系较近；类群B则包括3株菌(FJAT-55199、FJAT-55210、FJAT-55211)，分离自根部和茎部，与虚构芽胞杆菌属Fictibacillus的亲缘关系较近，其中FJAT-55199、FJAT-55211与Fictibacillusbarbaricus聚为一类，而FJAT-55210与Fictibacillusenclensis聚为一类；类群C包括6株菌(FJAT-55201、FJAT-55202、FJAT-55206、FJAT-55209、FJAT-55212、FJAT-55214)，分离自根部、茎部和叶部；与芽胞杆菌属的Bacillusaltitudinis、Bacillussafensis和Bacillusvelezensis亲缘关系较近；类群D包括4株菌(FJAT-55203、FJAT-55213、FJAT-55215、FJAT-55217)，分离自根部、茎部和叶部，与芽胞杆菌属的Bacilluscereus、Bacilluspseudomycoides和Bacillusparamycoides具有较近的亲缘关系。

图1 基于16S rRNA基因序列的内生芽胞杆菌系统发育分析

2.4 紫苏不同组织内生芽胞杆菌的分布

由表3可知，芽胞杆菌在紫苏的根、茎、叶中都有分布，呈现出种类和数量上的差异。7种内生芽胞杆菌仅存在于植物单一组织中，如国化室虚构芽胞杆菌Fictibacillusenclensis，只在茎中分离到；而副蕈状芽胞杆菌Bacillusparamycoides仅存在于叶部中，紫苏则根部分布了较多独特的芽胞杆菌种类，包括了贝莱斯芽胞杆菌Bacillusvelezensis、高地芽胞杆菌Bacillusaltitudinis、假蕈状芽胞杆菌Bacilluspseudomycoides、环状芽胞杆菌Nialliacirculans和巨大普利斯特菌Priestiamegaterium。另外，有4种内生芽胞杆菌在不同组织中同时被分离到，其中奇异虚构芽胞杆菌Fictibacillusbarbaricus同时存在于根部和茎部，阿氏普利斯特菌Priestiaaryabhattai同时存在于根部和叶部，而沙福芽胞杆菌Bacillussafensis和蜡样芽胞杆菌Bacilluscereus则同时存在于叶部和茎部。

表3 内生芽胞杆菌在紫苏植株中的分布

以芽胞杆菌在不同组织内的分布种类为样本，数据经标准化转化后进行聚类，结果见图2。当欧氏距离为3.63时，11种内生芽胞杆菌可以分为3类。第1类包括5个菌：巨大普利斯特菌Priestiamegaterium、环状芽胞杆菌Nialliacirculans、假蕈状芽胞杆菌Bacilluspseudomycoides、高地芽胞杆菌Bacillusaltitudinis和贝莱斯芽胞杆菌Bacillusvelezensis，5种芽胞杆菌均只分布在紫苏的根部组织中；第2类包括2个菌：阿氏芽胞杆Priestiaaryabhattai和副蕈状芽胞杆菌Bacillusparamycoides，只存在于叶部组织中；第3类包括4个菌：分别为蜡样芽胞杆菌Bacilluscereus、沙福芽胞杆菌Bacillussafensis、奇异虚构芽胞杆菌Fictibacillusbarbaricus、国化室虚构芽胞杆菌Fictibacillusenclensis，特征为在茎部组织内分布，其中国化室虚构芽胞杆菌Fictibacillusenclensis)单独分布在植物的茎中，而奇异虚构芽胞杆菌Fictibacillusbarbaricus同时存在于植物的根、茎中，蜡样芽胞杆菌Bacilluscereus、沙福芽胞杆菌Bacillussafensis同时存在茎部和叶部中。

图2 以种类为样本的芽胞杆菌聚类分析

2.5 紫苏内生芽胞杆菌的多样性分析

利用表2为矩阵，以紫苏不同组织为样本，芽胞杆菌种类为指标，对紫苏内生芽胞杆菌多样性进行分析表明，紫苏根部的Shannon多样性指数(1.7987)均高于茎部(1.3863)和叶部(1.3863)，在丰富度方面，根部的丰富度(2.5022)也高于茎部(2.1640)和叶部(2.1640)。

表4 芽胞杆菌种类在紫苏中的分布情况

3 讨论

在农业微生物领域，内生菌能产生多样的活性物质，且与宿主植物关系密切，更有利于生防作用的发挥[14]，在植物病害生物防治中具有巨大应用潜力[14-15]。芽胞杆菌是一类重要的植物内生菌，广泛地分布在多种植物的多个组织中[11]。本研究从紫苏根、茎、叶中分离到的内生菌，经16S rRNA基因测序鉴定，归属于芽胞杆菌科Bacillaceae的4个属，11个种。紫苏不同组织中含有丰富的内生芽胞杆菌种类，包括了奇异虚构芽胞杆菌Fictibacillusbarbaricus、国化室虚构芽胞杆菌Fictibacillusenclensis、为高地芽胞杆菌Bacillusaltitudinis、假蕈状芽胞杆菌Bacilluspseudomycoides、贝莱斯芽胞杆菌Bacillusvelezensis、沙福芽胞杆菌Bacillussafensis、蜡样芽胞杆菌Bacilluscereus、副蕈状芽胞杆菌Bacillusparamycoides、环状芽胞杆菌Nialliacirculans、阿氏普利斯特菌Priestiaaryabhattai和巨大普利斯特菌Priestiamegaterium。本研究探明紫苏内生芽胞杆菌种类的同时，也丰富了植物组织内部这种极端环境下的芽胞杆菌分布踪迹。

植物内生菌在宿主植物组织中的分布规律是内生菌对外界适应的重要机制，菌体及其代谢产物能对调控植株生长发育以及环境胁迫适应等方面产生重要影响[16]。同时，细菌多样性对揭示细菌种群结构功能及其与生存环境的相关性至关重要[13]。本研究分析了紫苏内生芽胞杆菌在植物体内的多样性和分布特征。芽胞杆菌在紫苏的根、茎、叶中都有分布，呈现出种类和数量上的差异。4种内生芽胞杆菌在不同组织中同时存在，包括了奇异虚构芽胞杆菌Fictibacillusbarbaricus同时存在于根部和茎部；阿氏普利斯特菌Priestiaaryabhattai同时存在于根部和叶部；而沙福芽胞杆菌Bacillussafensis和蜡样芽胞杆菌Bacilluscereus则同时存在于叶部和茎部，剩余的7种芽胞杆菌只存在于植物的单一组织中。在内生菌分布多样性方面，紫苏根部的Shannon多样性指数(1.798 7)均高于茎部(1.386 3)和叶部(1.386 3)，在丰富度方面，根部的丰富度(2.502 2)也高于茎(2.164 0)和叶(2.164 0)。郑榕等[11]研究表明药用植物夏枯草Prunellavulgaris根部组织内生芽胞杆菌，在种类和数量都高于茎、叶部组织，芽胞杆菌在植株体内的分布规律与本研究的结果相似。

药用植物及其生境中的微生物关系密切，相互影响，相互作用，形成了植物-微生物共生体系，成为近来药用植物研究热点[17]。本文通过对紫苏内生菌的多样性和分布特性分析，探明了紫苏内生芽胞杆菌资源，也为研究内生芽胞杆菌与宿主植物的相关性提供了基础和依据。