美丽薄子木内生真菌Rhytidhysteron sp.BZM-9化学成分研究

张莎，旷敏，彭伟伟，郑雨婷，许立，曾广源，邹振兴*（1.中南大学湘雅药学院，长沙 410013；2.慢病诊疗小分子药物发现与转化湖南省重点实验室，长沙 410013）

植物内生真菌是天然产物的重要资源，它们栖息在宿主植物的不同器官、组织内，对宿主植物本身不会引起任何疾病[1]。从微生物，尤其是植物内生真菌和海洋微生物中寻找和发现活性新颖的先导化合物已成为当前的研究热点[2-3]。近年来，内生真菌产生的多种生物活性代谢物具有重要的社会经济价值，在农业（作为生物肥料/生物刺激剂）和环境（生物修复）中被广泛应用[2]。

美丽薄子木（Leptospermum brachyandrum）为桃金娘科（Myrtaceae）鱼柳梅属（Leptospermum）小乔木或灌木，原产于澳大利亚。由于其观赏及药用价值引入我国，目前在广东、广西等地广泛种植。研究显示，桃金娘科植株富含精油及间苯三酚类成分，具有较好的抗菌活性[4-8]。但目前国内外关于该科植物美丽薄子木的化学成分及其内生真菌的研究鲜少。课题组前期通过组织分离法从美丽薄子木植物中分离出一株内生真菌，经ITS测序鉴定为Rhytidhysteronsp.BZM-9。经文献检索发现，目前国内外对于该属真菌的化学成分研究较少，仅报道几个色原酮[9]及螺二萘成分[10-12]。因此，为了进一步探明其化学多样性，本文利用现代色谱及光谱技术从中分离鉴定出15 个化合物（见图1），并对部分化合物进行了抗菌和细胞毒活性评价。

图1 化合物1 ～15 的化学结构Fig 1 Structures of compounds 1 ～15

1 材料

Bruker AV-400/AV-500/AV-600 型核磁共振仪（德国Bruker 公司）；Agilent 1290 UPLC-6545 accurate mass Q-TOF 色谱-质谱联用仪、Agilent 1200 型分析高效液相色谱仪、Agilent 1100 型半制备型高效液相色谱仪（美国Agilent 科技公司）；YMC-pack ODS-A 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；YMC-pack ODS-A 色谱柱（250 mm×10 mm，10 μm）；C18反相硅胶（40 ～75 μm，日本Kasugai）；硅胶（60 ～100 目，200 ～300 目，青岛海洋化工有限公司）；Sephadex LH-20 凝胶（德国Healthcare Uppsala Swedeb）；所用试剂均为分析纯。

HepG2 和SMMC-7721 肝癌细胞（中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心）；实验菌株MRSA（Methicillin-resistantStaphylococcus aureus）及Escherichia coli来自广东省微生物培养中心。

实验目标菌株分离自美丽薄子木枝叶，美丽薄子木枝叶于2016年9月采自中国科学院华南植物园，由华南植物园王发国副研究员鉴定。该真菌由北京擎科新业生物技术有限公司经ITS 序列分析鉴定为Rhytidhysteronsp.BZM-9，目前该样品标本保存于中南大学湘雅药学院天然药物化学实验室。

2 菌株的发酵、萃取及其代谢产物的分离

用接种环挑取适量菌丝接种至装有200 mL PDB 的三角瓶中，在恒温培养摇床中培养5 d（28℃，130 r·min－1），制备得到种子液。将种子液接种至无菌大米培养基中，共培养60 瓶，室温下静态发酵培养30 d，得到固体发酵物。发酵完成后用乙酸乙酯将大米发酵物萃取3 次，将有机溶剂减压蒸发获得粗提物浸膏（50 g）。

乙酸乙酯浸膏经硅胶柱层析，采用PE-EAMeOH（100∶0∶0 ～0∶0∶100）梯度洗脱，得到10 个组分（Fr.A ～Fr.J）。Fr.F 再经硅胶柱层析，以CH2Cl2-MeOH（100∶0 ～0∶100）梯度洗脱，得到8 个组分（Fr.F-1 ～Fr.F-8）。Fr.F-3 经反复硅胶柱层析及Pre-HPLC 得到化合物1（20.3 mg）、2（15.8 mg）、7（3.5 mg）、8（5.8 mg）和9（10.3 mg）。Fr.F-4 经Sephadex LH-20 柱层析，甲醇洗脱，得到4 个组分（Fr.F-4-1 ～Fr.F-4-4）。Fr.F-4-2 依次经硅胶柱层析、Pre-HPLC 得到化合物3（7.3 mg）、4（2 mg）、5（6.6 mg）和6（1.6 mg）。Fr.F-5 经ODS 柱层析，采用MeOHH2O（20∶80 ～100∶0）梯度洗脱，得到8 个组分（Fr.F-1 ～Fr.F-8）。Fr.F-2 经Pre-HPLC 得到化合物14（2.1 mg）。Fr.F-3 依次经硅胶柱层析、Pre-HPLC 得化合物10（5.4 mg）。

Fr.E 经ODS 柱层析，采用MeOH-H2O（20∶80～100∶0）梯度洗脱，得到8 个组分（Fr.E-1 ～Fr.E-8）。Fr.E-5 经反复硅胶柱层析，再通过Pre-HPLC得到化合物11（2.3 mg）和13（3.5 mg）；Fr.E-6 依次经硅胶柱层析、Pre-HPLC 得到化合物12（8.5 mg）；Fr.E-7 经反复硅胶柱层析得到化合物15。

3 结构鉴定

化合物1：白色无定型粉末，易溶于甲醇和二甲基亚砜（DMSO），HR-ESI-MSm/z：259.0608 [M＋H]＋。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.24（1H，d，J＝2.4 Hz，H-6），6.69（1H，d，J＝3.0 Hz，H-5'），6.60（1H，d，J＝3.0 Hz，H-3'），6.35（1H，d，J＝2.4 Hz，H-4），2.75（3H，s，6'-CH3）。13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：140.0（C-1），98.9（C-2），166.2（C-3），102.2（C-4），166.9（C-5），105.8（C-6），167.6（C-7），111.0（C-1'），154.5（C-2'），102.7（C-3'），159.9（C-4'），118.6（C-5'），139.8（C-6'），25.9（6'-CH3）。以上数据与文献报道[13]基本一致，化合物1 鉴定为alternariol。

化合物2：褐色固体，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：275.0555 [M ＋H]＋。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.23（1H，d，J＝1.8 Hz，H-9），6.68（1H，s，H-2），6.35（1H，d，J＝1.8 Hz，H-7），2.66（3H，s，H-10）。13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：126.9（C-1），116.3（C-2），146.3（C-3），130.9（C-4），141.3（C-4a），164.8（C-5a），97.5（C-6），100.6（C-7），165.0（C-8），104.2（C-9），139.1（C-9a），109.8（C-9b），23.9（C-10），165.4（C-11）。 以上数据与文献报道[14]基本一致，化合物2 鉴定为porric acid E。

化合物3：黄色固体，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：223.0987 [M ＋H]＋。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：6.39（1H，s，H-4），1.97（3H，s，H-11），1.89（1H，m，H-8a），1.80（1H，m，H-8b），1.48（3H，s，H-10），0.64（3H，t，J＝7.2 Hz，H-9）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：169.3（C-1），86.6（C-3），99.5（C-4），163.2（C-5），111.4（C-6），155.2（C-7），153.5（C-3a），103.5（C-7a），32.5（C-8），8.6（C-9），26.2（C-10），8.1（C-11）。以上数据与文献报道[15]基本一致，化合物3 鉴定为3-ethyl-5，7-dihydroxy-3，6-dimethylphthalide。

化合物4：白色针状晶体，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：209.0814 [M ＋H]＋。1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ：5.20（2H，s，H-3），3.85（3H，s，H-10），2.09（3H，s，H-9），2.06（3H，s，H-8）。13C-NMR（125 MHz，DMSO-d6）δ：169.2（C-1），68.5（C-3），113.7（C-4），162.4（C-5），118.4（C-6），155.8（C-7），147.3（C-3a），107.4（C-7a），11.8（C-8），9.6（C-9），62.4（C-10）。以上数据与文献报道[16]基本一致，化合物4 鉴定为5-羟基-7-甲氧基-4，6-二甲基-2-苯并呋喃酮。

化合物5：黄色固体，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：223.0626 [M ＋H]＋。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.18（1H，s，H-10），5.35（2H，s，H-3），3.92（3H，s，H-9），2.01（3H，s，H-8）。13H-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：172.5（C-1），70.1（C-3），114.8（C-4），168.5（C-5），121.0（C-6），160.9（C-7），152.5（C-3a），104.9（C-7a），9.2（C-8），61.8（C-9），190.6（C-10）。以上数据与文献报道[17]基本一致，化合物5 鉴定为6-formyl-7-hydroxy-5-methoxy-4-methylphalide。

化合物6：黄色固体，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：223.0626 [M ＋H]＋。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.91（1H，s，H-7），5.22（2H，s，H-3），3.87（3H，s，H-9），2.16（3H，s，H-8）。13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：172.8（C-1），68.3（C-3），150.0（C-4），120.2（C-5），161.1（C-6），96.8（C-7），123.5（C-3a），126.9（C-7a），7.9（C-8），55.0（C-9）。以上数据与文献报道[18]基本一致，化合物6 鉴定为4-hydroxy-6-methoxy-5-methylphthalide。

化合物7：白色固体，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：271.0582 [M ＋Na]＋。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：6.71（1H，d，J＝2.4 Hz，H-6），6.65（1H，d，J＝2.4 Hz，H-8），5.96（1H，s，H-3），4.03（2H，s，H-1'），3.55（3H，s，-OCH3），2.28（3H，s，H-9）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：164.7（C-2），118.9（C-3），178.2（C-4），137.4（C-5），110.8（C-6），161.1（C-7），102.1（C-8），114.2（C-4a），159.5（C-8a），19.9（C-9），40.1（C-1'），171.6（C-2'），51.7（-OCH3）。以上数据与文献报道[19]基本一致，化合物7 鉴定为2-甲基-5-甲氧羰甲基-7-羟基色原酮。

化合物8：白色固体，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：235.0968 [M ＋H]＋。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：6.66（1H，d，J＝2.4 Hz，H-8），6.62（1H，d，J＝2.4 Hz，H-6），5.97（1H，s，H-3），4.03（1H，m，H-2'），2.65（3H，s，H-9），2.58（2H，m，H-1'），1.15（3H，d，J＝6.4 Hz，H-3'）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：165.3（C-2），112.0（C-3），178.8（C-4），141.8（C-5），116.9（C-6），161.4（C-7），101.1（C-8），114.9（C-4a），159.6（C-8a），43.3（C-1'），64.5（C-2'），23.9（C-3'），22.9（5-CH3）。以上数据与文献报道[20]基本一致，化合物8 鉴定为2-（2'-hydroxypropyl）-5-methyl-7-hydroxychromone。

化合物9：白色固体，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：213.0507 [M ＋H]＋。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.64（1H，d，J＝2.4 Hz，H-6），6.63（1H，d，J＝2.4 Hz，H-8），6.00（1H，s，H-3），2.71（3H，s，H-10），2.32（3H，s，H-9）。13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：166.7（C-2），115.6（C-3），182.1（C-4），163.2（C-5），118.1（C-6），143.7（C-7），101.7（C-8），111.4（C-4a），161.5（C-8a），19.9（C-9），23.2（C-10）。以上数据与文献报道[21]基本一致，化合物9 鉴定为altechromones A。

化合物10：浅黄色固体，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：193.0864 [M ＋H]＋。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：7.44（1H，dd，J＝7.8，1.8 Hz，H-8），7.41（1H，t，J＝7.8 Hz，H-7），7.28（1H，dd，J＝7.8，1.8 Hz，H-6），5.10（1H，t，J＝3.6 Hz，H-4），3.85（3H，s，-OCH3），2.96（1H，m，H-2a），2.41（1H，m，H-2b），2.11（2H，m，H-3）。13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：198.3（C-1），32.7（C-2），30.6（C-3），58.9（C-4），157.3（C-5），116.5（C-6），129.4（C-7），118.0（C-8），133.5（C-9），132.6（C-10），56.4（-OCH3）。以上数据与文献报道[22]基本一致，化合物10 鉴定为4-O-methylscleron。

化合物11：浅黄色固体，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：237.1121 [M ＋H]＋。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：6.18（1H，s，H-5），5.21（1H，m，H-2'），3.75（3H，s，H-8），1.95（3H，s，H-9），1.77（3H，s，H-4'），1.67（3H，d，J＝6.4 Hz，H-3'）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：103.7（C-1），160.7（C-2），109.4（C-3），160.5（C-4），109.3（C-5），146.8（C-6），171.3（C-7），52.4（C-8），8.6（C-9），138.7（C-1'），120.6（C-2'），14.1（C-3'），18.7（C-4'）。以上数据与文献报道[23]基本一致，化合物11 鉴定为pilobolusate。

化合物12：深褐色固体，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：179.1071 [M ＋H]＋。1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ：9.03（2H，br s，1/3-OH），6.32（2H，s，H-4，H-6），5.72（1H，q，J＝6.5 Hz，H-2'），1.90（3H，s，H-3'），1.86（3H，s，H-4'），1.70（3H，d，J＝6.5 Hz，H-7）。13C-NMR（125 MHz，DMSO-d6）δ：156.3（C-1），109.1（C-2），156.3（C-3），103.8（C-4），141.5（C-5），103.8（C-6），8.9（C-7），135.5（C-1'），120.6（C-2'），14.5（C-3'），15.7（C-4'）。以上数据与文献报道[24]基本一致，化合物12 鉴定为aspergillusphenols A。

化合物13：淡黄色固体，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：183.0656 [M ＋H]＋。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：6.15（1H，d，J＝2.4 Hz，H-4），6.14（1H，d，J＝2.4 Hz，H-2），3.79（3H，s，-OCH3），2.27（3H，s，H-8）。13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：161.6（C-1），100.9（C-2），167.4（C-3），110.8（C-4），141.2（C-5），106.1（C-6），170.7（C-7），22.5（C-8），52.2（-OCH3）。以上数据与文献报道[25]基本一致，化合物13 鉴定为苔色酸甲酯。

化合物14：黄色固体，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：146.0401 [M ＋H]＋。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.14（1H，br s，-NH-），9.93（1H，s，H-10），8.29（1H，s，H-2），8.09（1H，d，J＝7.8 Hz，H-4），7.52（1H，d，J＝7.8 Hz，H-7），7.25（2H，m，H-5/6）。13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：139.0（C-2），118.6（C-3），123.9（C-4），122.6（C-5），120.8（C-6），112.9（C-7），137.5（C-8），124.6（C-9），185.5（C-10）。 以上数据与文献报道[26]基本一致，化合物14 鉴定为1H-indole-3-carboxaldehyde。

化合物15：黄色固体，易溶于氯仿，HRESI-MSm/z：393.3153 [M ＋H]＋。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：6.61（1H，d，J＝9.5 Hz，H-7），6.02（1H，d，J＝9.5 Hz，H-6），5.74（1H，s，H-4），5.24（2H，m，H-22/23），1.06（3H，d，J＝6.5 Hz，H-21），1.00（3H，s，H-19），0.96（3H，s，H-18），0.93（3H，d，J＝7.0 Hz，H-28），0.84（6H，d，J＝6.5 Hz，H-26/27）。13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：34.1（C-1/C-2），199.5（C-3），123.0（C-4），124.5（C-5），124.4（C-6），134.0（C-7），164.4（C-8），44.3（C-9），36.8（C-10），19.0（C-11），35.6（C-12），44.0（C-13），156.1（C-14），25.4（C-15），27.7（C-16），55.7（C-17），19.0（C-18），16.7（C-19），39.3（C-20），21.1（C-21），135.0（C-22），132.5（C-23），42.9（C-24），33.1（C-25），20.0（C-26），19.7（C-27），17.7（C-28）。以上数据与文献报道[27]基本一致，化合物15 鉴定为ergosta-4，6，8（14），22-tetraen-3-one。

4 生物活性测定

4.1 抗肿瘤活性测定

以阿霉素（上海爱研化工科技有限公司，批号：AYCB1087）为阳性对照，测试了化合物3～6和11 ～13 对两种肝癌细胞（HepG2 和SMMC-7721）的增殖抑制活性。首先将HepG2和SMMC-7721 细胞株在含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液中，于37℃、5% CO2的培养箱内培养。收集对数生长期的两种肝癌细胞，以1×104个细胞/孔接种于96 孔板，贴壁培养24 h 后。每孔分别加入2 μL 待测化合物，阴性对照组和空白组分别加入等体积DMSO 和培养液。培养48 h 后，再加入20 μL MTT 溶液，继续孵育4 h。弃去上清液，每孔加入150 μL DMSO，结晶充分溶解后，用酶标仪在490 nm 波长处测定各孔吸光度值，并计算IC50值。

结果显示，只有化合物12 对SMMC7721细胞显示出较强的细胞毒活性（IC50＝0.338 μmol·L－1），其活性相当于阳性对照阿霉素（IC50＝0.3 μmol·L－1），其余化合物在测试的最大浓度下（≥80 μmol·L－1）均未显示出增殖抑制活性。

4.2 抗菌活性测定

以万古霉素（上海麦克林生化科技有限公司，批号：V871983）为阳性对照，参考美国临床实验室标准委员会（CLSI20150）标准，采用96 孔板二倍稀释法测试化合物3 ～6 和11 ～14对MRSA 及Escherichia coli的最低抑菌浓度（MIC）值。结果显示，仅化合物12 对MRSA 显示出较好的抑制活性（MIC＝6.25 μg·mL－1），其余化合物在测试的最大质量浓度下（≥ 50 μg·mL－1）对MRSA 及Escherichia coli均未显示出抑制活性。

5 结果与讨论

植物内生真菌具有普遍性和多样性，自然界几乎所有的植物组织中均含有内生真菌，其参与植物生长过程中的重要环节，不仅能代谢产生与宿主植物相同或相似的代谢产物，自身还能生成许多活性代谢物，是活性先导化合物的重要来源。

本研究从美丽薄子木植物内生真菌Rhytidhysteronsp.BZM-9 乙酸乙酯提取物中共分离鉴定出15 个化合物，包括6 个酚酸类、4 个苯酞类、3 个色原酮、1 个吲哚生物碱及1 个甾体，以上所有化合物均为首次从该属真菌中分离得到。活性测试结果显示化合物12 可能为抗菌或抗肿瘤药物开发提供先导化合物。以上研究结果不仅丰富了Rhytidhysteron属真菌化学成分多样性，也为进一步开发美丽薄子木内生真菌的次生代谢产物提供一定的研究基础。