沉默狼疮相关肺动脉高压高表达的HMGB1通过TLR4/NF-κB途径抑制低氧诱导的PASMC增殖、迁移及胶原合成①

李鸣远 孟 岩 武云（新疆医科大学第一附属医院全科医学科，乌鲁木齐 830054）

肺动脉高压（pulmonary hypertension，PAH）是系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）严重的并发症之一，随着肺动脉压力与肺部血管阻力的渐进性升高，可导致右心室衰竭而死［1-2］。由于SLE-PAH发病机制尚未完全阐明，导致临床药物治疗存在明显局限性，因此更深层地了解其发病机制有助于改善患者的疗效及预后。

目前公认PAH的病理基础是由肺动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMC）异常增殖和胶原蛋白等细胞外基质蛋白积累而导致肺血管壁重塑［3-4］。但驱动PASMC异常生理活动的分子基础并未得到明确阐述。近年来，越来越多的证据表明炎症在PAH的发病机制中起着至关重要的作用，并且SLE-PAH相对于其他类型的PAH有更强的炎症状态［5-7］。高迁移率族蛋白1（high mobility group box-1，HMGB1）是一种由细胞主动或被动分泌的致炎因子，多研究显示HMGB1在PAH患者肺部表达明显上调，并能促发炎症反应及肺血管重构，从而诱导PAH发生［8-9］。

关于HMGB1在SLE-PAH中是通过何种信号通路诱发PASMC异常的生理活动目前仍未见报道。TLR4/NF-κB是参与机体炎症反应的重要信号通路之一。XUE等［10］证实了HMGB1通过TLR4/MyD88/NF-κB途径促进了炎症细胞因子的释放，心肌细胞的迁移、黏附和聚集，加重了心肌缺血性输液损伤，加重了心肌梗死面积。YU等［11］研究发现HMGB1的抑制通过TLR4和NF-κB信号通路抑制NLRP3介导的炎症反应，从而改善坏死性肠结肠炎。可见HMGB1与TLR4/NF-κB途径的相互调控在炎症反应中发挥了重要作用。

由此推测，SLE患者体内高表达的HMGB1可能是通过激活TLR4/NF-κB途径诱发炎症反应，促进PASMC的过度增殖、迁移与胶原合成，最终诱发PAH的发生。本研究在临床样本验证的基础上设计PASMC的体外培养实验，进一步明确HMGB1参与SLE-PAH疾病进展的作用机制。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料选取新疆医科大学第一附属医院2019年3月至2021年3月收治的健康体检者（健康对照组）、SLE患者（SLE组）、SLE-PAH（SLE-PAH组）作为研究对象，纳入标准：SLE符合1997年美国风湿病协会制定的SLE分类诊断标准［12］，PAH的诊断符合多普勒超声测定肺动脉收缩压（pulmonary artery systolic pressure，PASP）≥30 mmHg［13］。排除标准：由间质性肺疾病、肺栓塞、心功能不全、心肌梗死等引发的PAH。本研究已通过本院伦理委员会审批，所有患者均对本研究知情，并签署知情同意书。正常对照组30例，平均年龄（37.1±12.4）岁，男11例，女19例；SLE组33例，平均年龄（35.8±10.3）岁，男14例，女19例，SLE持续时间（59.3±30.1）个月，SLEDAI得分为（12.4±4.8）分；SLE-PAH组31例，平均年龄（36.9±7.9）岁，男15例，女16例，SLE持续时间（65.5±39.9）个月，SLEDAI得分为（10.8±5.1）分，3组性别组成与年龄无显著性差异，SLE组与SLE+PAH组SLE持续时间、SLE疾病活动度指数（disease activity index of SLE，SLEDAI）得分无差异。

1.1.2 仪器与试剂全自动生化分析仪（7600型，日本日立）；PCR仪器（美国ABI 7500荧光定量PCR仪）；液体闪烁计数器（liquid scintillation counter，美国Perkin Elmer）；电泳仪（Bio-Rad，美国）；PASMC（武汉云克隆科技股份有限公司）；LipofectamineTM2000（Invitrogen，美国）；MTT检测试剂盒（酶联生物，上海）；酶标仪（America，美国）；EdU细胞增殖检测试剂盒（锐博生物科技有限公司，广州）；荧光显微镜（fluorescence microscope，日本奥林巴斯）；逆转录试剂盒、RT-PCR检测试剂盒（美国赛默飞科技）；BCA定量试剂盒（碧云天公司，上海）；Boyden小室（Hm-Kylin/海门麒麟公司）。

1.2 方法

1.2.1 彩色多普勒超声检查使用彩色多普勒仪，M4s探头，频率为2.0～3.5 MHz，嘱患者取左卧位，扫查患者胸骨旁长、短轴、四腔室，测量三尖瓣反流，估测PASP，ePASP=（4×TRV2）+RAP，其中TRV为最大三尖瓣反流速度，RAP为右房压。

1.2.2 SLEDAI根据SLE疾病活动度评分量表对SLE-PAH患者SLEDAI进行评分，SLEDAI≥8定义为SLE活动期，另为非活动期。

1.2.3 PAH严重程度分级根据PASP对SLEPAH患者PAH的严重程度进行分级。轻度：PASP 30～40 mmHg，中 度：PASP 41～70 mmHg，重 度：PASP≥71 mmHg。

1.2.4 血浆HMGB1含量检测空腹采集患者的外周静脉血，迅速分离血浆，采用全自动生化分析仪测定血浆中HMGB1含量。比较3组受试者血浆HMGB1含量，并分析不同SLE活动度、PAH严重程度分级的SLE-PAH患者血浆中HMGB1含量。

1.2.5 细胞培养PASMC采用DMEM高糖培养基（含有10%FBS），在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，培养至第4～6代使用。

1.2.6 siRNA转染将PASMC培养至30%～50%融合，使用LipofectamineTM2000转染25μmol siRNANC/siRNA-HMGB1，转染6 h后，将细胞在含血清培养基中培养24 h后进行后续实验。所有siRNA均由上海吉玛制药技术有限公司合成。

1.2.7 细胞增殖测定采用MTT法与EdU实验测定PASMC细胞增殖情况，MTT实验：于96孔板接种（2×103个/孔），培养24 h后按照MTT检测试剂盒说明书加入MTT试剂，孵育4 h，酶标仪测定细胞在490 nm处的吸光值。EdU实验：使用EdU细胞增殖检测试剂盒，加入50μmol/L EdU试剂4 h，1μg/ml DAPI染色20 min，于荧光显微镜下观察染色阳性细胞，计算EdU阳性率。

1.2.8 细胞迁移测定采用Boyden小室试验测定PASMC细胞迁移能力，将PASMC重新悬浮在含有0.4%BSA的无血清DMEM培养基中，取1×104个细胞加入Boyden上室。下腔充满含0.4%BSA的无血清培养基，孵育5 h后，将穿透并附着在滤膜底部的细胞固定于甲醇中，并在室温下用Giemsa溶液染色20 min。使用显微镜观察细胞，并记录每孔随机选择区域的细胞计数。

1.2.9 胶原合成测定采用胶原酶消化法测定细胞胶原蛋白的合成，将PASMC置于含有抗坏血酸（50μg/ml）和β-氨基丙腈（80μg/ml）的［2，3，4，5-3H］L-脯氨酸中持续24 h。移出培养基并将其添加到等体积的冷Tris缓冲液（0.1 mmol/L，pH=7.4）中，缓冲液含有0.65 mmol/L NaCl、5.0 mmol/L CaCl2、2.5 mmol/L N-乙基马来酰亚胺和100μg/ml牛血清白蛋白，添加三氯乙酸（10%）在4℃下絮凝30 min，于14 000 g、4℃离心10 min，95%冷乙醇洗涤2次，干燥，0.2%SDS溶解，液体闪烁计数器测定。

1.2.10 RT-PCR采用RT-PCR测定细胞中HMGB1 mRNA的相对表达量，以GAPDH作为内部参照基因，HMGB1基因的相对表达水平采用2-ΔΔCt表示。引物序列为：HMGB1正向：5′-GCCGGGAGGAGCACAAGAAGAA-3′，反向：5′-GCCTTGTCAGCCTTTGCCATATCT-3′，GAPDH正向：5′-ACGGCAAGTTCAACGGCACAGTCA-3′，反向：5′-AGCGGAAGGGGCGGAGATGA-3′。

1.2.11 Western blot采用Western blot测定HMGB1、TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β、COL1、COL3蛋白质的含量。RIPA裂解法提取总蛋白，BCA定量试剂盒定量，使用10%SDS-PAGE于电泳仪进行分离，转移至PVDF膜，加入相应的抗体孵育，4℃隔夜，然后用辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5 000稀释），室温下孵育1 h，使用Image-Lab软件检测生物发光，并对蛋白质进行定量。

1.3 统计学处理采用GraphPad Prism 8.0进行数据的统计与图形的绘制，实验数据均采用±s表示，多组间数据的分析采用单因素方差分析，两两之间的比较采用LSD-t检验，当P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HMGB1在SLE-PAH患者血浆与低氧培养的PASMC中的表达上调结果显示，SLE-PAH患者血浆中HMGB1水平高于SLE患者与正常对照，SLE患者HMGB1水平亦高于正常对照，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.001，图1A）；进一步对HMGB1与SLE-PAH患者病情的关系进行分析，结果显示，SLE活动期患者血浆HMGB1水平高于非活动期（P＜0.05，图1B），PAH重度患者血浆HMGB1水平高于轻中度患者（P＜0.05，图1C）。采用低氧环境培养PASMC模拟PAH环境，测定HMGB1 mRNA与蛋白质的表达，以常氧条件下培养的PASMC作为对照，结果发现，低氧诱导促进了HMGB1 mRNA与蛋白质的表达上调（P＜0.01，P＜0.001，图1D、E）。

图1 临床SLE-PAH患者血浆与低氧培养的PASMC中HMGB1的水平分析Fig.1 Analysis of HMGB1 level in plasma of patients with SLE-PAH and PASMC induced by hypoxia

2.2 沉默HMGB1抑制低氧诱导PASMC的增殖、迁移与胶原合成及TLR4/NF-κB通路的表达结果显示，低氧诱导促进了细胞增殖、迁移（P＜0.001，图2A～C）与胶原合成（P＜0.001，图2D、E），而沉默HMGB1则 逆 转 了 此 变 化（P＜0.01，P＜0.001，图2A～E），以上提示低氧诱导了HMGB1表达增强，从而促进了PASMC增殖、迁移与胶原合成。同时，测定了TLR4/NF-κB通路相关蛋白的表达，结果显示，低氧诱导激活了PASMC细胞中TLR4/NF-κB通路蛋白的表达，而在沉默HMGB1后则又逆转了此变化（P＜0.001，图2F）。

图2 沉默HMGB1抑制了低氧诱导的PASMC增殖、迁移与胶原合成及TLR4/NF-κB通路表达Fig.2 Silencing HMGB1 inhibited proliferation，migration and collagen synthesis of PASMC and expression of TLR4/NF-κB pathway induced by hypoxia

2.3 激活TLR4逆转siRNA-HMGB1对低氧诱导PASMC增殖、迁移与胶原合成的抑制作用如图3所示，为进一步验证低氧诱导下HMGB1是否通过TLR4/NF-κB通路调控PASMC增殖、迁移与胶原合成，采用siRNA-HMGB1与TLR4的激活剂LPS分别处理PASMC，均给予低氧培养，结果显示，在siRNAHMGB1干预的基础上采用LPS处理，能逆转siRNAHMGB1对低氧诱导PASMC增殖、迁移（P＜0.05）与胶原合成（P＜0.01）的抑制作用，同时还观察到，LPS处理使siRNA-HMGB1对TLR4/NF-κB通路的抑制作用也得到逆转（P＜0.01）。

图3 激活TLR4逆转siRNA-HMGB1对低氧诱导PASMC增殖、迁移与胶原合成的抑制作用Fig.3 Activation of TLR4 reverses inhibitory effect of siRNA-HMGB1 on proliferation，migration and collagen synthesis of PASMC induced by hypoxia

3 讨论

HMGB1是一种细胞核非组蛋白DNA结合蛋白，具有复杂的生物学效应，参与了细胞增殖、迁移、分化、炎症、肿瘤发展等生理/病理过程，是近年来国内外研究热点之一［14］。

本研究中首先在临床样本中证实了HMGB1与SLE-PAH的关系：与正常受试者及SLE患者相比，SLE-PAH患者血浆中HMGB1含量显著升高，且处于SLE活动期与合并重度PAH的患者血浆HMGB1含量高于SLE非活动期与合并轻中度PAH的患者。这说明HMGB1与SLE-PAH疾病的进展密切相关。既往研究已证实SLE患者血清中HMGB1蛋白升高，与SLE疾病活性相关［15-16］。SLE是一种以产生抗核抗体（ANA）为特征的自身免疫性疾病，ANA能与HMGB1结合形成复合物后放大机体的炎症反应［17］。YAO等［18］研究中发现HMGB1是PAH药物治疗中主要的靶点蛋白之一。BAUER等［19］证实HMGB1可介导TLR4的活化促进PAH的进展。YUKARI等［20］证实HMGB1在肺动脉高压小鼠模型中表达增加，促进了炎症反应，并使肺血管壁增厚。上述研究结果均为单纯探讨HMGB1与SLE或PAH疾病之间的关系，而本研究直接探讨了HMGB1在SLE-PAH疾病进展中的作用，可为SLE-PAH疾病的临床诊治实践提供一定的参考。

随后本研究采用PASMC体外细胞培养实验来探讨HMGB1在SLE-PAH进展中的作用机制，结果证实低氧诱导PASMC可促进HMGB1表达，而HMGB1是通过激活TLR4/NF-κB信号通路促进PASMC增殖、迁移及胶原合成。TLR4/NF-κB信号通路是炎症反应的主要调控通路之一，TLR4是一类跨膜蛋白，能特异性识别病原相关分子模式，并在免疫和炎症反应中发挥重要作用；TLR4通过与髓样分化蛋白88或其他接头蛋白结合后，使得核转录因子NF-κB p65亚单位磷酸化激活，进入细胞核促进炎症细胞因子TNF-α、IL-1β等的表达［21］。近年来研究指出TLR4还能识别体内危险信号［22］。HMGB1可作为损伤模式相关分子，是危险信号分子激活模式的识别受体。因而在低氧或SLE导致的炎症环境下，HMGB1的表达上调，被TLR4识别后，激活了NF-κB，从而产生了炎症级联放大反应，PASMC细胞过度增殖、迁移，合成胶原，促进了肺血管重构，最终引发或加重了PAH［23］。

综上所述，HMGB1通过TLR4/NF-κB途径抑制低氧诱导的PASMC增殖、迁移及胶原合成，是SLEPAH未来可能的生物标志物及治疗靶标之一。