参附舒络丸的质量控制及急性毒性实验研究*

张丙丽，王晓娟，孟菲，王爱青

1.洛阳市中医院，河南 洛阳 471003；2.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450012；3.洛阳市药品检验所，河南 洛阳 471003

洛阳市中医院制剂室始建于1982年，2000年初具规模，并于2016年进行扩充改建，共有制剂批准文号42个，以水丸（浓缩丸）为主，涵盖了口服液、糖浆剂、散剂、颗粒剂等多个剂型，在临床应用广泛。目前，本院已对部分制剂进行了关于制备工艺、有效性、药理毒理等方面的相关研究［1-5］。参附舒络丸具有活血化瘀、舒筋活络、散结止痢的功效，用于治疗气滞血瘀、脉络痹阻、各种骨关节疼痛、颈肩腰腿疼痛、腰肌劳损等疾病，在骨科、疼痛科应用广泛，是建设本院制剂室之初的老方剂，制备工艺简便，疗效确切，但一直未对其制备工艺、质量控制、药理毒理进行研究，本研究首先须明确其质量控制标准。

参附舒络丸的质量控制标准有外观性状检查，鉴别项包括了薄层色谱，检查项包括了水分、重量差异、装量差异、溶散时限、微生物限度检查等项目，尤其关注了乌头碱的含量检查，采用了薄层色谱限量检查的方法，检测项目完善，较全面的反映了参附舒络丸的质量，但也有不足之处，比如乌头碱含量测定的方法、药理毒理的相关研究等还不太全面。

中药管理中的毒性药品一般指1988年11月颁布的《医疗用毒性药品管理办法》中规定的28种毒性中药饮片［6-9］，28种毒性中药饮片多为生品，其实临床中应用的多为炮制品，炮制品可以不按照此规定管理，但考虑到虽为炮制品，毒性大大减弱，但仍含有毒性成分，具有一定毒性，尤其是医院制剂品种中含有含毒性成分的饮片时，更是缺乏相关毒理学研究［10-13］，考虑到临床上服药剂量、服用时长、患者年龄、机体体质等因素均可能影响到毒性的发挥，因此，有必要关注此类制剂的安全性。

参附舒络丸处方中含有制川乌、制草乌两种含毒性成分的中药饮片，不存在中药十八反、十九畏等相关禁忌情况。制川乌、制草乌化学成分为双酯型二萜类生物碱，包括乌头碱、次乌头碱、杰斯乌头碱、异翠雀碱等，是乌头中的主要毒性成分［14-17］。根据文献报道，制川乌、制草乌的毒性主要表现在消化系统、神经系统、呼吸系统、循环系统等，如流涎、恶心、呕吐、腹泻、呼吸困难、手足抽搐、大小便失禁，抽步态蹒跚、角弓反张，甚至心脏衰竭与呼吸抑制导致死亡［18-21］。本研究为充分暴露潜在的不良反应，采用灌胃给药的方式考察了参附舒络丸单次给药的急性毒性反应。

1 材料

1.1 动物SPF级ICR小鼠60只，体质量17～22 g，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0011。动物试验流程及相关操作遵守《实验动物管理条例》。

1.2 药物与试剂参附舒络丸（洛阳市中医院涧西院区制剂室，批号：20200212）；乙醚、乙酸乙酯、苯、乙酸、无水乙醇、正己烷、氨、NaOH、碘化铋钾（天津市大茂化学试剂厂，批号：190125、20191101、20191008、20191005、20191106、20191101、20191005、20190907、20180608）；丹参对照药材（中国食品药品鉴定研究所，货号：110766-201520）硅胶G薄层板（青岛海洋化工有限公司，规格：100 mm×100 mm批号：20190526）。

1.3 仪器超声清洗仪（宁波海曙科生超声设备有限公司，型号：KS-500D）；电热鼓风恒温干燥箱（上海市崇明实验仪器厂，型号：101-1型）；分析天平（上海上平仪器有限公司，型号：FA1004）购自；崩解时限仪（天津广谱光学仪器有限公司，型号：BJ-1）；生物安全柜（上海跃进医疗器械有限公司，型号：BSC-1100IIB2-X）；医用洁净工作台（济南新贝西生物技术有限公司，型号：BBS-SDC）；细菌培养箱（济南新贝西生物技术有限公司；型号：SPX-150）；霉菌培养箱（济南新贝西生物技术有限公司，型号：MJ-160）。

2 方法

2.1 质量控制

2.1.1 性状与鉴别本品为棕色至棕褐色水丸，味苦。取本品5 g，粉碎成粉末，加入乙醚20 mL，超声处理5 min，过滤，滤液干燥，残渣加入乙酸乙酯1 mL溶解，作为试验溶液。此外，以丹参为对照药材，采用相同方法制备对照药材溶液。根据测试的薄层色谱法（《中华人民共和国药典》2020年版通则0502），吸取5μL的上述两种溶液，并把它们点在同一硅胶G薄层板，分别以苯-醋酸（benzene-benzene-ethyl 19：1）为展开剂，展开，取出，干燥。

2.1.2 质量检查乌头碱 取本品30 g，研碎，置具塞锥形瓶中，加氨试液10mL，拌匀，加乙醚150mL，振摇1 h，放置1～2 h，过滤，滤液蒸干，加无水乙醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，制成供试品应用。另外，取乌头碱对照品，加入无水乙醇，制成2.5 g·L-1的参比溶液。按薄层色谱法检验《中华人民共和国药典》，取试验液20μL和对照液4μL，点在0.5%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，展开，以正己烷-乙酸乙酯（1∶1）为展开剂，取出干燥，喷以稀碘化铋钾试液。

2.2 急性毒性实验

2.2.1 药物制备制备方法：按照参附舒络丸复方比例，取牛膝、生地黄、黄芪、当归、桑寄生、秦艽等，加水煎煮3次。第1次2 h，第2次1 h，第3次40 min，合并药液，浓缩至相对密度约为1.20。余药材烘干粉碎成细粉，以浓缩液为赋形剂，混合烘干，粉碎成一定细度，并过筛，混合均匀后泛制成丸，打光，即得1 000 g水丸。

2.2.2 分组及给药将60只ICR小鼠按体质量和性别随机分为6组，分别为参附舒络丸组（8 g·kg-1）、参附舒络丸组（6.0 g·kg-1）、参附舒络丸组（4.5 g·kg-1）、参附舒络丸组（3.4 g·kg-1）、参附舒络丸组（2.6 g·kg-1）、参附舒络丸组（2.0 g·kg-1），每 组 各10只。各 组 均 给 予20 mL·kg-1灌胃，给药前禁食14～16 h，给药后观察6 h，每日观察1次，共14 d。

2.2.3 一般状况观察包括外观、饮食、分泌物、排泄物、行为等。记录以及所有动物中毒反应的开始时间、持续时间、严重程度、可逆性，以及中毒症状、死亡。

2.2.4 体质量测量给药后1 d、2 d、3 d、5 d、7 d、11 d和14 d分别测量动物的体质量，包括垂死或死亡的动物。

2.2.5 脏器检查濒临死亡的动物或中毒死亡的动物应及时进行解剖，在观察期结束后的其他动物，经颈椎脱臼处理进行大体解剖。当大体解剖显示器官颜色、体积、质地等变化时，用质量浓度10%中性福尔马林固定异常器官，并进行组织病理学检查。一般解剖学检查器官包括食道、气管、胸腺、肾上腺、胰腺、膀胱、前列腺、睾丸（包括附睾）、子宫、卵巢、心脏、肺、肝、脾、肾、脑、淋巴结、胃、肠。

2.3 统计学方法采用SPSS 21.0软件对结果进行统计，计量资料结果以均数±标准差（±s）表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 质量控制结果质量控制的各项指标均符合《中华人民共和国药典》的标准。

3.2 小鼠的一般状况 参附舒络丸组（8 g·kg-1）有7只在给药30 min后先后出现呼吸加快或急促、活动减少、低伏、俯卧不动、步履不稳、翻正反射消失、抽搐、尿失禁、呼吸减慢或加深中的多种状态，先后在给药后的5 h内死亡。3只出现俯卧不动或活动减少的状态，但3 h内都基本恢复，后续一般状态观察中无明显异常。参附舒络丸组（6 g·kg-1）有4只在给药65 min后先后出现活动减少、步履不稳、排稀便、低伏、俯卧不动、抽搐、尿失禁、翻正反射消失中的多种状态，先后在给药后的7 h内死亡。有2只在给药60 min后先后出现活动减少，但3 h内基本恢复，后续一般状态观察中无明显异常。参附舒络丸组（4.5 g·kg-1）有1只在给药82 min后出现活动减少、步履不稳、低伏、俯卧不动、呼吸减慢或加深、排稀便、尿失禁、翻正反射消失中的多种状态，在给药后7 h内死亡。有1只在给药35 min后，出现活动力减弱，但6 h内基本恢复。有2只给药3 h后出现排稀便，但给药后第2天至第14天一般状态观察无明显异常。参附舒络丸组（3.4 g·kg-1）有4只在给药后1 h内先后发生活动减少的状态，但在3 h内基本恢复，后续一般状态观察中无明显异常。参附舒络丸组（2.6 g·kg-1）在给药当天以及给药后的第2天至第14天一般状态观察无明显异常。参附舒络丸组（2.0 g·kg-1）在给药当天以及给药后的第2天至第14天一般状态观察无明显异常。参附舒络丸组（8.0 g·kg-1）可致7只死亡，参附舒络丸组（6.0 g·kg-1）可致4只死亡；参附舒络丸组（4.5 g·kg-1）可致1只死亡。参附舒络丸组（3.4 g·kg-1、2.6 g·kg-1、2.0 g·kg-1）不会导致动物死亡。据此计算出参附舒络丸的半数致死量为6.7 g·kg-1。

3.3 各组小鼠体质量比较参附舒络丸组（8.0 g·kg-1）中有3只小鼠（雌性2只、雄性1只）观察期14 d内体质量保持增长。参附舒络丸组（6.0 g·kg-1）有6只小鼠（雌性3只、雄性3只）在观察期14 d内体质量均保持增长。参附舒络丸组（4.5 g·kg-1）有9只小鼠（雌性5只、雄性4只）在观察期14天内体质量均保持增长。其余各组小鼠在观察期14 d内体质量均保持增长，见表1、表2。

表1 ICR雄性小鼠体质量变化情况 （±s，g）

时间 参附舒络丸组（8.0 g·kg-1）参附舒络丸组（6.0 g·kg-1）参附舒络丸组（4.5 g·kg-1）参附舒络丸组（3.4 g·kg-1）参附舒络丸组（2.6 g·kg-1）参附舒络丸组（2.0 g·kg-1）第1天 21.0±0.0 20.5±0.7 21.2±0.8 20.8±1.1 21.3±0.8 21.6±0.9第2天 23.1±0.0 22.6±0.5 23.2±0.6 23.7±0.7 24.4±0.7 24.8±0.9第3天 24.1±0.0 24.3±0.8 24.8±0.8 25.8±0.6 26.8±0.6 25.8±0.8第5天 26.8±0.0 25.9±0.4 26.0±1.1 27.5±0.6 28.3±0.9 28.6±1.2第7天 28.6±0.0 28.9±1.0 29.1±0.9 28.7±0.8 30.4±0.7 29.7±1.2第11天 30.8±0.0 29.9±1.2 31.6±0.8 31.9±0.9 32.4±0.5 31.9±0.8第14天 31.7±0.0 31.6±0.9 32.4±1.0 33.6±1.3 33.1±0.5 32.8±0.9总增重 10.7±0.0 11.2±0.8 9.1±0.8 11.2±1.2 12.8±0.8 13.1±1.0

表2 ICR雌性小鼠体质量变化情况 （±s，g）

时间 参附舒络丸组（8.0 g·kg-1）参附舒络丸组（6.0 g·kg-1）参附舒络丸组（4.5 g·kg-1）参附舒络丸组（3.4 g·kg-1）参附舒络丸组（2.6 g·kg-1）参附舒络丸组（2.0 g·kg-1）第1天 19.8±0.8 18.4±0.7 17.8±0.9 18.6±0.7 19.2±0.9 20.1±1.0第2天 21.5±0.8 20.4±0.7 19.7±0.1 20.0±0.6 21.2±1.2 21.6±0.7第3天 22.6±1.0 21.9±0.4 21.7±0.7 22.1±1.0 22.9±1.4 23.1±1.0第5天 23.7±0.4 24.1±0.1 23.5±0.5 24.3±1.0 24.1±0.9 24.7±1.2第7天 25.6±1.3 25.8±0.0 25.1±1.0 26.2±1.1 25.3±0.7 26.0±0.8第11天 27.3±0.8 27.1±0.7 26.1±1.0 27.8±0.8 26.8±0.9 27.4±1.3第14天 28.1±0.4 27.9±0.5 26.9±1.2 29.6±1.0 27.8±1.0 28.3±0.8总增重 8.3±0.9 9.2±0.6 8.9±0.9 9.1±1.1 8.7±1.0 8.2±1.3

3.4 脏器检查各组动物大体解剖肉眼观察均未见异常变化。

4 讨论

参附舒络丸的质量标准指标比较完善，但其中乌头碱的含量测定采用薄层色谱法，该方法比较粗略，并不够精确。乌头碱的含量测定方法很多，主要有高效液相色谱法、反相高效液相色谱法、液相-质谱联用方法、双波长薄层扫描法、高效毛细管电泳法和分光光度法［22-25］，质谱联用的多反应监测扫描方法在测定含乌头类生物碱时，具有较强的灵敏性和专属性，也适用于基质成分比较复杂的情况。薄层色谱法因设备简单，操作方便，且其具备分离与定量的双方面作用，在医院制剂定性及含量测定中应用广泛，其他色谱法受医院实验条件的限制，在现在批准的医院制剂室中应用较少。分光光度法设备简单，可以尝试应用。高效液相色谱法是常用含量测定方法，高效液相色谱法灵敏度、准确度、自动化程度高，且重现性好，也是广泛应用的方法，下一步应探索高效液相色谱法的在院内制剂生产中的应用，这样能更准确地反映有效成分、毒性成分的含量，这样有助于提高院内制剂的整体标准，并为进一步提高药品质量提供保障。

参附舒络丸在临床使用中并未发现有不良反应。本研究首选了含毒性中药饮片的方剂进行实验，初步考察了本类制剂的急性毒性反应，为院内该类制剂的急性毒性试验提供了方法学上的探索。参附舒络丸中含有的川乌、草乌水煎液灌胃给药，产生毒性的主要靶器官为心、肝、脾、肺、肾等，对小鼠消化系统、呼吸系统、神经系统、循环系统等均具有不同程度的毒性，甚至出现神志不清、昏迷，循环系统衰竭死亡［26］。本研究确定了该制剂的半数致死量，相关试验结果与相关文献报道基本一致，毒性反应与剂量成正相关。