鱼藤素通过AKT/FoxO1信号通路诱导胃癌细胞凋亡的作用机制

李 黎 孙 川 刘 莉 邓 洁 晏 菲 魏武杰

(湖北省第三人民医院肿瘤内科，武汉，430000)

胃癌是临床上常见的消化道恶性肿瘤，在我国各种恶性肿瘤中发病率居第2位，是全球发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一[1-2]。一般情况下胃癌发生早期无明显症状，易被忽略，因此胃癌早期诊断较为困难，给临床治疗带来了极大困难[3]。临床上胃癌治疗多以化疗或手术切除为主，化疗不良反应大，同时对患者的身心影响大，因此寻求更加安全有效的药物，减少药品不良反应，是目前胃癌治疗的一个难题。近年来研究结果表明，中药活性成分毒性低，作用靶点多，对于恶性肿瘤的防治作用备受关注，显示出了巨大的潜力。

鱼藤素(Deguelin，De)是植物中常见的鱼藤酮类化合物，药理学研究显示具有显著的杀虫、抑制生长发育的作用[4-5]。研究表明，鱼藤素对癌症的抵抗作用显著，尤其是抑制肺癌、舍鳞癌和肝癌等恶性肿瘤有明显作用[6-8]。相关研究显示，鱼藤素可对蛋白激酶(AKT)进行选择性抑制，从而对癌细胞起到一定抑制作用。AKT信号通路的活化在胃癌、肝癌等多种恶性肿瘤发生过程中具有重要作用。Ho等[10]研究表明，在胃癌肿瘤中AKT基因过表达。但是，目前尚未有研究表明鱼藤素可以抑制胃癌细胞基因从而导致癌细胞死亡。因此，本研究采用人体胃癌细胞进行实验，探索鱼藤素作用于胃癌细胞的机制，为防治胃癌提供严谨科学的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 SGC-7901人类胃癌细胞，来自于中科院生物化学与细胞生物学研究所，许可证：SYXK(京)2016-0001，干冰运输的冻存细胞，液氮保存，长期有效。

1.1.2 药品 鱼藤素，上海源叶生物科技有限公司，批号：522-17-8，纯度>95%。

1.1.3 试剂与仪器 AKT过表达质粒载体(汉恒生物科技有限公司，批号：12390912)DMEM高糖培养基(Gibco公司，美国，批号：12491-015)、胎牛血清(Gibco公司，美国，批号：10099-14-FBS)、青-链霉素(Gibco公司，美国，批号：15070063)等，CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所，日本，批号：CK04)，叉头框蛋白O1(Forkhead Box O1，FoxO1)、B细胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相关蛋白(Bcl-2-associated X Protein,Bax)mRNA、β-肌动蛋白(actin)上下游引物和探针(InvitrogenTM公司，美国，批号：12010121)，荧光定量PCR试剂(DBI公司，批号：16051012)，FoxO1兔单克隆抗体(美国CST公司，美国，批号：2880)、β-actin(美国CST公司，美国，批号：4970)兔单克隆抗体(美国CST公司，美国，批号：14021202)、p-AKTThr308兔单克隆抗体(美国CST公司，美国，批号：13038)、辣根过氧化物酶-羊抗兔IgG二抗(美国CST公司，批号：7074)、Bcl-2兔单克隆抗体(美国CST公司，美国，批号：4223)等，BCA的蛋白定量试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司，美国，批号：23227)、RNA提取试剂(Thermo Fisher Scientific公司，美国，批号：23209)、超敏化学发光液(Thermo Fisher Scientific公司，美国，批号：34580ECL)、细胞蛋白提取试剂(Thermo Fisher Scientific公司，美国，批号：78501)，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶快速制备试剂盒(EpiZyme Scientific公司，美国，批号：18D250)，研究用水为超纯净水，其余实验试剂均符合实验室要求。

CO2培养箱(三洋公司，日本，型号：MCO-18AC)；酶标仪(Bio-Rad公司，美国，型号：Bio-rad xMark)、细胞计数器(Bio-Rad公司，美国，型号：TC20)、实时定量PCR仪(美国伯乐公司，美国，型号：CFX96)、蛋白转膜仪(美国伯乐公司，美国，型号：全能型)，离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司，型号：CTK120R)、分析天平(梅特勒-托利多公司，瑞士，型号：MS-TS)，化学成像分析系统(Syngene公司，英国，型号：GBOX)、倒置显微镜(Olympus Corporation，日本，型号：CKX31)、恒温水浴锅(武汉格莱莫检测设备有限公司，型号：HH-S4)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将SGC-7901人类胃癌细胞植入杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle Medium，DMEM)高糖培养基中，将温度调至37 ℃，CO2浓度调至5%进行培养，观察胃癌细胞生长发育状态。本研究已获得医学伦理委员会审核准许(伦理审批号：HBSDSRMYY201208063326)。

DMEM高糖培养基的配置：10%胎牛血清，青霉素100 U/mL，链霉素100 μg/mL。

1.2.2 鱼藤素溶液配置 将1 mL DMSO与39.4 mg鱼藤素相溶取得浓度100 mmol/L的母液作为对照，储存于-20 ℃的环境中。取一定量母液在培养基中稀释至10 mmol/L的浓度作为工作液，再用微孔为0.22 μm的滤膜过滤。

1.2.3 分组与鱼藤素给药浓度筛选 选取处于生长期的细胞，加入胰酶消化液可制得细胞悬液，并用细胞计数器对其计数。在96孔板中将细胞悬液铺匀，使其每孔体积为100 μL，数量达到5 000个，将孔板分为3组，分别为对照组、空白组、浓度不同药物组，并在每组设置6个复孔。3个对照组中分别加入含鱼藤素(10、20、40、60、80、100 mol/L)的培养基，给药后分别在24 h和48 h时向孔中添加10 μL CCK-8试剂，并继续培养2 h。使用酶标仪进行吸光度测定后可算出细胞的成活度，重复上述实验步骤。细胞成活率(%)=(A给药-A空白)/(A对照-A空白)×100%。

He didn’t ask for a meal, but a drink of water. She could see he was hungry.Soon she brought him a large glass of milk, “How much do I 2)owe you?” he asked.

1.2.4 分组与给药 1)选择对数生长期的细胞种植于100 mm培养皿中，并分成对照组、20 μmol/L鱼藤素组和40 μmol/L鱼藤素组，24 h后取细胞进行检测，并反复多次进行实验。2)取对数生长期细胞，接种于100 mm培养皿中，设对照组、模型组(AKT过表达载体转染)及鱼藤素给药组(AKT过表达载体转染后给予相应浓度鱼藤素干预)，不同剂量的鱼藤素给药作用24 h后，收集细胞用于检测分析，进行重复实验。

1.2.5 鱼藤素对SGC-7901细胞中AKT/FoxO1信号通路相关蛋白表达的影响 SGC-7901胃癌细胞按1.2.4的1)中的方法进行分组给药，采用蛋白提取试剂的方法在给药结束后进行蛋白提取，用BCA试剂盒对蛋白含量进行测定。先将蛋白样品进行电泳分离，再将其转至厚度为0.45 μm的聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride，PVDF)膜上，将5%脱脂牛奶进行1 h的密封，Bcl-2等一抗(1∶1 000)、FoxO1、p-AKTThr308在摇床温度为4 ℃的情况下过夜，使用洗涤缓冲液(Tris Buffered Saline Tween,TBST)进行3次清洗工作，每次工作10 min，使用G:BOX成像分析系统在显色之后获得条带，将β-actin作为内参。进行灰度值分析时采用Image J图像软件进行分析。

1.2.6 鱼藤素对AKT基因转染SGC-7901胃癌细胞中AKT/FoxO1信号通路相关蛋白表达的影响 SGC-7901细胞按1.2.4的2)中方法进行分组给药，采用蛋白提取试剂的方法在给药结束后进行蛋白提取，并用BCA试剂盒对蛋白含量进行测定按1.2.5中的方法检测p-AKTThr308、FoxO1、Bcl-2等蛋白的表达。

1.2.7 鱼藤素对FoxO1、Bcl-2、Bax mRNA表达的影响 SGC-7901胃癌细胞按1.2.4的2)中方法进行分组给药，给药结束后运用RNA提取试剂盒提取GC-7901胃癌细胞中的RNA，取RNA2 μg和50 mmol/LOligo-dt1 μL混匀，于65 ℃水浴5 min后马上放于冰上进行降温，并向其加入4 μL的5×RT缓冲液、1 μL的莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus，M-MLV)，将2 μL的10 mmol/L脱氧核苷三磷酸(Deoxyribonucleoside Triphosphate，dNTP)和焦碳酸二乙酯(Diethyl Pyrocarbonate,DEPC)水补足反应体系后进行混合、离心，离心半径20 cm，转速30 000 r/min，离心10 min。PCR仪上操作：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min；PCR条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，73 ℃延伸45 s，扩增30个循环，以β-actin为内参，取PCR扩增产物10 μL，于1%琼脂糖凝胶中电泳，并在此过程中使用凝胶成像分析仪进行全程拍摄，提取所有GAPDH吸收度和待测基金的比值，得到引物序列见表1。

表1 引物序列

2 结果

2.1 鱼藤素浓度和作用时间对SGC-7901细胞成活率的影响 SGC-7901胃癌细胞成活率与鱼藤素给药浓度、作用时间成反比，即鱼藤素用药浓度越大、作用时间越长，SGC-7901胃癌细胞成活率越低，其中40 μmol/L的鱼藤素作用24 h和48 h后的SGC-7901胃癌细胞成活率分别为78.2%和64.6%，鱼藤素具有诱导癌性细胞SGC-7901凋亡，抑制其增殖的作用。其中鱼藤素用药浓度为20 μmol/L和40 μmol/L，作用24 h为最佳给药方案。见图1。

图1 鱼藤素浓度和作用时间对SGC-7901细胞成活率的影响

图2 鱼藤素对SGC-7901胃癌细胞中AKT/FoxO1信号通路相关蛋白表达的影响

2.3 鱼藤素对AKT基因转染SGC-7901胃癌细胞中AKT/FoxO1信号通路相关蛋白表达的影响 与对照组比较，在AKT基因转染的模型组中SGC-7901胃癌细胞的Bcl-2和p-AKTThr308等蛋白表达水平有上升趋势，而FoxO1的蛋白表达水平呈下降趋势,差异均有统计学意义(均P<0.01)。经过20、40 μmol/L鱼藤素给药作用24 h后均能够降低p-AKTThr308、Bcl-2等蛋白的表达水平，升高FoxO1蛋白的表达水平，与AKT基因转染的模型组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见图3。

图3 鱼藤素对AKT基因转染SGC-7901胃癌细胞中AKT/FoxO1信号通路相关蛋白表达的影响

2.4 鱼藤素对FoxO1、Bcl-2、Bax mRNA表达水平的影响 与对照组比较，AKT基因转染的模型组SGC-7901胃癌细胞中Bcl-2、Bax mRNA表达水平显著升高(P<0.01)，FoxO1 mRNA表达水平降低(P<0.01)；与模型组比较，经过20、40 μmol/L鱼藤素给药作用24 h后均能够降低Bcl-2 mRNA的表达水平，升高FoxO1、Bax mRNA的表达水平，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 鱼藤素对FoxO1(左)、Bcl-2(中)、Bax(右)mRNA表达水平的影响

3 讨论

胃癌作为临床中常见的消化道恶性肿瘤，具有较高的致死率与并发症，对患者的生命健康有极大的威胁[11]。随着近几年医疗科技手段的不断进步与普遍使用，越来越多的方法可以用于防治恶性肿瘤的发展，现阶段主要研究方向为靶向调节。研究表明，原癌基因AKT经常在胃癌中过表达或激活[12-13]。同时通路下游的分子AKT可通过磷酸肌醇-3激酶进行调节，可以有效抑制糖脂代谢、细胞生长、恶性肿瘤和胰岛素信号的形成，对于肿瘤的发生、发展具有重要作用[14-15]。Yu等[16]研究表明，SGC-7901胃癌细胞中AKT信号通路被激活，提示AKT信号通路在胃癌发生发展中可能具有重要作用。FoxO1作为AKT信号通路下游的一个转录调节因子，不仅对恶性肿瘤的形成与细胞增殖具有明显的作用，还对细胞的新陈代谢、发育、分裂分化均有一定的作用。实验结果显示，影响胃癌细胞的因素分为多种，而FoxO1的表达对肿瘤细胞的发育、凋亡有着直接关系[17-18]。其中抑制肿瘤细胞凋亡的重要基因之一是Bcl-2，而可引起人体细胞加快死亡的重要基因为Bax，当Bax基因过表达，则会降低Bcl-2基因的保护作用，从而使细胞凋亡速度加快。

陈立加等[19]研究发现，胃癌细胞SGC7901/VCR在不同浓度鱼藤素下的活力受到不同程度的抑制作用，并浓度、时间具有梯度依赖性。鱼藤素可能是对抗胃癌多药耐药以及细胞活力有影响，可作为一种潜在药物深入研究。

鱼藤素是AKT信号通路的抑制剂，具有显著的抗癌活性。AKT/FoxO1信号通路在肿瘤抗凋亡及增殖过程中发挥着重要作用[20]。本实验在体外以SGC-7901胃癌细胞作为研究对象，考察鱼藤素对SGC-7901胃癌细胞中p-AKTThr308、FoxO1、Bcl-2等蛋白表达的调节作用，同时运用AKT过表达载体转染使SGC-7901胃癌细胞中AKT表达水平升高，然后再给予鱼藤素作用，考察鱼藤素对AKT/FoxO1信号通路相关基因表达的影响。研究结果表明鱼藤素能够抑制p-AKTThr308蛋白的表达，升高FoxO1的表达从而抑制Bcl-2的表达，升高Bax的表达水平从而诱导SGC-7901胃癌细胞凋亡[21-22]。

综上所述，鱼藤素能够通过AKT/FoxO1信号通路调节凋亡相关因子的释放从而诱导SGC-7901胃癌细胞凋亡，对于胃癌的防治具有一定的作用。