基于网络药理学探讨参芪五味子片治疗失眠的作用机制

何玉瑶 刘晓庆 杨艳平 董云芳 赵 赫 韩 树 张 靖 侯晓莹

(1 北京中医药大学东直门医院，北京，100010; 2 山东省潍坊市中医院,潍坊，261000)

参芪五味子片复方中的主要药物组成是南五味子、黄芪、党参及酸枣仁。在复方中南五味子敛肺滋肾，宁心安神，黄芪和党参补气健脾，生津养血，酸枣仁养血安神，共奏健脾益气，养心安神之效，在心脾两虚型的失眠治疗中显示出了良好的疗效。中药复方由多种中药配伍组成，其活性成分与作用靶点间具有复杂的网络关系[6]。参芪五味子片可以通过多靶点、多通路、多机制的协同或拮抗作用，改善失眠。网络药理学的出现为系统高效揭示中药复方分子作用机制带来了新机遇[7]。它通过对多种数据库进行整合分析，建立可视化的网络关系图，进而预测药物治疗疾病可能的作用机制，以填补现代药理学研究的不足之处[8]。本研究借助网络药理学方法，探讨参芪五味子片治疗失眠的潜在作用机制，以期更好地分析和研究参芪五味子片复方，为中医药的临床应用及药理学研究提供一个全新的方向。

1 资料与方法

1.1 参芪五味子片药物活性成分及靶点的筛选 以参芪五味子片的组方中的药物“南五味子”“酸枣仁”“黄芪”和“党参”为检索词，将口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)设为≥30%，类药性(Drug Likeness，DL)设为≥0.18，从中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)中筛选出参芪五味子片中药物的活性成分及相关靶点[9]。接着，从TCMSP筛选出药物候选活性成分的相关靶点，通过Uniprot数据库(http//www.Uniprotorg/)将所得到的靶点进行标准化处理[10]。最后剔除没有靶点的活性成分，建立药物有效活性成分及作用靶点数据库。

1.2 参芪五味子片组方中药物-活性成分-靶点网络图的构建 将参芪五味子片组方中的中药、活性成分及靶点导入到Cytoscape 3.7.2软件中构建参芪五味子片组方的药物-活性成分-靶点网络图。其中，网络中的节点代表特定的中药、药物活性成分或蛋白靶点，边则代表成分与靶点间的相互作用。节点的度(Degree)值表示与这个节点所相连的边的数量，其Degree值越大，说明该节点在整个网络中更加具有“中心性”。利用Cytoscape 3.7.2软件中的CytoHubba插件对该网络进行关键靶点的分析，Degree值排前3位的靶点被认为是参芪五味子药物活性成分治疗失眠的关键靶点。

1.3 检索失眠相关靶点数据 以“insomnia”为检索词，限定条件为“Homo sapiens”，从Drugbank数据库(https://www.drugbank.ca)、OMIM数据库(https://www.omim.org/)，以及DisGeNET数据库(http://www.disgenet.org/)中获取失眠相关的疾病靶点。

1.4 预测参芪五味子片治疗失眠的潜在靶点 借助Venny2.1.0在线绘图软件，将参芪五味子片中活性成分的相关靶点和有关失眠的靶点取交集，得到参芪五味子片治疗失眠的潜在靶点。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)网络构建及网络拓扑学分析 使用Cytoscape软件的BiosoGenet插件分别构建药物活性成分相关靶点的PPI网络和失眠相关的疾病靶点PPI网络，提取2个PPI网络的交集部分构成1个新的交集网络。对所得到的交集网络选用“中介中心性”(Betweenness Centrality，BC)、“接近中心性”(Closeness Centrality，CC)、“度中心性”(Degree Centrality，DC)、“邻近中心性”(Neighborhood Connectivity，NC)及“局部平均连通性”(Local Average Connectivity，LAC)5个参数进行网络拓扑学分析，挖掘出核心节点。首先筛选出DC值大于2倍中位数的节点构成显著交集PPI网络，在此基础上进一步筛选出同时满足BC，CC，DC，NC，LAC分别大于中位数的网络节点构成核心PPI网络。为了系统地研究化合物之间复杂的协同作用，利用上述得到的药物生物活性成分相关靶点数据和已知的失眠相关的疾病靶点数据分别构建2个PPI网络。网络中的节点代表蛋白靶点，边表示相邻蛋白之间的相互作用。

1.6 富集分析 使用Metascape数据库(https://metascape.org/)进行基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析。GO注释分析由生物过程(Biological Process，BP)、分子功能(Molecular Function，MF)和细胞组分(Cellular Component，CC)3个部分组成。种属限定为“homo sapiens”，P<0.01。

2 结果

2.1 参芪五味子片中药物的活性成分及其作用靶点 运用TCMSP数据库，检索出了参芪五味子片中药物的所有活性成分293个，其中南五味子39个，酸枣仁33个，黄芪87个，党参134个。再根据OB≥30%，DL≥0.18，筛选出参芪五味子片中药物的活性成分共63个，其中南五味子13个，酸枣仁9个，黄芪20个，党参21个。见表1。应用TCMSP数据库得出参芪五味子片药物的全部作用靶点，并通过Uniprot数据库对这些作用靶点进行标准化处理，最后得到了45个药物有效活性成分和232相关靶点。

表1 参芪五味子片药物活性成分及相关靶点数

2.2 参芪五味子片药物-活性成分-靶点网络图的构建 参芪五味子片药物-活性成分-靶点网络中三角形代表参芪五味子片中的中药、椭圆形代表药物活性成分、矩形代表药物活性成分的靶点,六边形则代表中药共有的活性成分。网络共有280个节点,760条边,平均每个节点有2.71条边。节点的大小代表节点度的大小。连线越多，表示它们之间的相互作用越强烈。通过CytoHubba插件分析得出Quercetin(槲皮素)、Kaempferol(山柰酚)及Luteolin(木犀草素)是Degree值排名在前3位的药物活性成分，可认为是参芪五味子片治疗失眠的关键成分。见图1。

图1 参芪五味子片中药物-活性成分-靶点网络图

2.3 失眠相关的疾病靶点的检索及参芪五味子片治疗失眠的潜在作用靶点的预测 以“insomnia”为主题词检索Drugbank、OMIM、DisGeNET数据库，分别获得9个、83个、69个已知的失眠相关的疾病靶点。去除重复后，一共获得160个失眠相关的疾病靶点。参芪五味子片作用失眠的潜在靶点有13个，占所有靶点3.4%。见表2、图2。

表2 参芪五味子片药物-疾病潜在靶点

图2 参芪五味子片药物活性成分靶点与失眠靶点交集韦恩图

2.4 PPI网络的构建与核心节点筛选 药物生物活性化合物靶点PPI网络有6 775个节点和16 335条边(图3A)，失眠相关疾病靶点PPI网络共有3 446个节点和76 628条边(图3B)。通过提取2个PPI网络的重叠部分构建交集网络，获得药物生物活性成分-失眠相互作用的PPI网络，该网络共有2 467个节点和65 942条边(图3C)。筛选DC值大于2倍中位数(DC>68)的节点为显著节点，并构建显著交集PPI网络，该网络具有612个节点和25 769条边(图3D)。在此基础上筛选出同时满足BC、CC、DC、NC、LAC分别大于中位数的节点作为核心节点，并构建核心PPI网络(图3E)。BC、CC、DC、NC、LAC的中位数分别为0.000 772 21、0.469 702 74、107、125.906 997、20.889 080 46。共有55个节点和451条边。

图3 PPI网络的构建、网络拓扑学分析及核心靶点筛选

2.5 富集分析 利用Metascape数据库对上述步骤筛选得出的55个核心靶点进行GO注释及KEGG通路富集分析。GO功能条目中生物过程BP63种、细胞组分CC83种、分子功能MF93种，选取排名前10且P<0.01的功能进行可视化分析。见图4A～D。其中BP占GO功能富集条目的77.41%，包括mRNA代谢过程的调控，含核碱基化合物、mRNA、杂环、细胞氮化合物、芳香族化合物分、RNA、有机环化合物的分解代谢过程及mRNA和RNA稳定性调控等；CC占10.65%，包括黏着斑、细胞-基质黏附连接、细胞-基质连接、黏附连接、锚定连接、剪接体复合物、染色体端粒、核染色体端粒区、富含ficolin-1的颗粒腔及细胞质核糖核蛋白颗粒等；MF占11.94%，包括泛素-蛋白质连接酶、类泛素-蛋白质连接酶、错误折叠蛋白质、未折叠蛋白、热激蛋白、蛋白质结构域特异性及钙黏蛋白等的结合以及ATP酶活性。通过KEGG通路分析得到了30条信号通路，选取P<0.01且排名前20的通路进行分析，通路基本信息见表3。通路气泡图见图4E。X轴表示富集倍数，Y轴则表示通路名称，气泡面积表示通路所富集的基因数，气泡颜色的深浅则表示P值的大小。

表3 KEGG排名前20的通路基本信息(P<0.01)

图4 富集结果分析

3 讨论

心神司人之寤寐，失眠的病位主要在心。临床对失眠病因病机的描述有许多，如“胃不和则卧不安”“思虑伤脾，脾血亏损”等，总结起来归人体阴阳失调，营卫失和，阳不入阴，因此在治疗上当补虚泻实，调整阴阳。参芪五味子片是一种对南五味子、党参、黄芪及酸枣仁等中药成分进行提取而得到的复方制剂，具有健脾益气、养心安神的功效。张侠[11]通过实验研究发现参芪五味子片可以有效延长小鼠的睡眠时间、减少睡眠中小鼠的自发活动；乌冬梅等[12]在对参芪五味子片对失眠大鼠神经递质影响的研究中发现参芪五味子片可以升高大鼠脑干及下丘脑内的5-羟色胺含量，降低去甲肾上腺素含量，从而改变失眠大鼠的睡眠状况[13]。在临床中参芪五味子片治疗失眠患者的有效率高达90.63%，也有相关研究表明参芪五味子片对失眠的治疗效果明显优于镇静催眠类西药[14-15]。

本研究通过网络药理学方法探讨参芪五味子片治疗失眠的作用机制，区别于单纯的西药治疗的单分子、单通路模式，通过一系列网络模型的建立，彰显出中药复方通过多种成分、多个靶点和多类通路治疗疾病的优势。

通过TCMSP筛选出参芪五味子片中药物活性成分共63个，作用于失眠的潜在靶点13个。其中Drgee值排在前3位的药物活性成分分别是槲皮素(Quercetin)、山柰酚(Kaempferol)及木犀草素(Luteolin)。槲皮素是一种天然的黄酮类化合物，它可以激活或者抑制许多蛋白质的生物活性，具有一定的抗炎及抗氧化特性，也有研究报道说它具有潜在的抗抑郁作用。山柰酚是γ氨基丁酸转氨酶抑制剂，它在中枢神经系统具有镇静、抗焦虑的效果[16-17]。体外实验研究证实木犀草素可以通过调节炎症介质，抑制炎症的关键调节剂，如白细胞介素-1β及白细胞介素-2等细胞因子，改变相应的信号通路，减少细胞内活性氧的产生等通路发挥抗炎、抗氧化的作用[18-19]。

基于药物活性成分-靶点网络图、韦恩图以及PPI网络图得到参芪五味子片治疗失眠的潜在靶点有13个，分别为IL-6、CRP、GABRA1、GABRA2、GABRA3、EIF6、CYP3A4、CYP1A2、AHR、DRD1、SLC6A3、SLC6A4、NR3C1。失眠与中枢神经系统内神经递质的平衡失调相关。γ氨基丁酸是大脑中重要的神经递质，具有镇静催眠及抗焦虑等作用。GABRA1、GABRA2及GABRA3是γ氨基丁酸的门控离子通道，它们可以功能性地抑制γ氨基丁酸能突触的形成。临床大多数镇静催眠药物是通过γ氨基丁酸神经递质或刺激GABRA受体来发挥镇静作用，可见GABRA类门控离子通道参与调节的神经活性配体-受体相互作用通路以及相关的神经递质传递在失眠的治疗中起着不可或缺的作用[20-23]。芳烃受体是一类能够被配体所激活的转录激活因子，它参与细胞周期的调节，通过抑制影响昼夜节律的核心成分周期昼夜调节蛋白1(Period Circadian Regulator1，PER1)水平表达来调节昼夜节律。5-羟色胺和多巴胺是人大脑内重要的单胺类神经递质。5-羟色胺的各受体亚型可以调节人的睡眠及觉醒周期，在一定条件下，如果激动突触前的5-羟色胺1A受体，则可以延长人的慢波睡眠，减少觉醒次数；相反，如果激动突触后5-羟色胺1A受体，则可以抑制睡眠使人觉醒。溶质载体家族6成员4(Solute Carrier Family 6 Member 4，SLC6A4)它是一种5-羟色胺转运蛋白，它在中枢神经系统中的主要功能是影响5-HT分子在突触间的再利用，调节其信号的转导，在介导5-羟色胺对5-羟色胺能系统其他受体可用性的调节中起关键作用。多巴胺具有维持觉醒的作用，SLC6A3通过对突触前末端的高亲和力钠的重摄取来终止多巴胺使觉醒的作用，从而维持人的睡眠状态；IL-6是细胞因子的重要成分，在炎症反应中处于核心地位。文献为吴伟等[24]不是Friedman等通过对74例慢性失眠患者的研究发现其血清中IL-6水平高于正常人群，在提高睡眠质量以及改善患者的社会关系后，血清中IL-6的水平显著下降。在中枢神经系统中IL-6主要由大脑的星形胶质细胞分泌，它通过激活相关的基因转导通路，使神经再生减少。也有研究显示，IL-6对中枢神经系统的影响与突触的形成相关。它还可能通过色氨酸/犬尿氨酸以及甘油磷酸酯的代谢分泌通路进一步影响中枢神经系统。C反应蛋白是感染性病因的重要标志物，它通过其钙依赖性特征与磷酰胆碱的结合来促进凝集，干扰吞噬作用和补体固定，也可以与DNA及组蛋白相互作用，清除受损的循环细胞所释放的核物质。Bauml等[25]通过系统性研究发现失眠患者组C反应蛋白水平显著高于正常组，由此可见炎症介质对中枢神经系统的损伤作用可能是产生失眠的机制之一。

KEGG富集分析主要涉及MAPK信号通路，包括癌症中的蛋白多糖、军团菌、麻疹和甲型流感等疾病通路，细胞周期通路，糖皮质激素受体通路，剪接体、非同源末端连接、内质网中蛋白质加工等遗传信息处理通路，抗原加工和呈递免疫通路以及雌激素信号通路等。其中促分裂原活化的蛋白激酶级联是一个高度保守的模块，涉及到多种细胞功能的执行，如：细胞的增殖、迁移和分化。它在细胞外刺激所引起的细胞反应性级联中起着不可忽视的作用，Nakatani等[26]研究发现，阿尔茨海默病伴失眠及焦虑患者血清中常存在着促分裂原活化的蛋白激酶表达的升高，在失眠及焦虑症状缓解后，促分裂原活化的蛋白激酶的表达也相应地降低。睡眠与炎症密切相关，军团菌、麻疹、甲型流感等疾病诱导机体产生一些炎症介质，这些炎症介质扩散进入大脑在一定程度上会刺激和损伤人体的中枢神经系统，产生一系列病理生理变化，改变其活动和睡眠调节，产生失眠。失眠也与细胞的死亡及衰老等周期性变化相关，它使与DNA损伤和细胞衰老相关的基因表达增加，如衰老信号标志物周期蛋白依赖性激酶抑制因子(Cyclin-dependent KinaseInhibitor 2A，CDKN2A)，抑制人体细胞周期的进展。昼夜节律可以调节炎症活性及夜间皮质醇的短暂释放，当人体血中皮质醇与糖皮质激素受体的结合被阻断时，CD4和CD8T细胞分泌的IL-2和TNF细胞因子就会增加，这些炎症介质进入人体大脑，刺激中枢神经系统，产生失眠。

本研究运用网络药理学方法探讨参芪五味子片治疗失眠的生物活性成分和潜在的作用机制，结果表明，参芪五味子片具有多种成分、多个靶点和多类通路治疗失眠的作用机制，其潜在机制涉及神经递质代谢、炎症、细胞周期等方面，虽然目前仍有一些通路及机制尚未得到实验验证，但可以为今后阐明参芪五味子片治疗失眠的具体机制提供思路，也可为参芪五味子片临床治疗失眠提供更多依据。