基于网络药理学研究补肾方治疗阿尔茨海默病的作用机制

姚 璇 时 晶 王 旭 倪敬年 魏明清 李 婷 田金洲

(北京中医药大学东直门医院，北京，100700)

阿尔茨海默病(Alzheimer Disease，AD)是一种以记忆力减退、认知功能障碍为主要临床表现的神经退行性疾病，至今尚无理想的治疗方法。目前美国食品药品管理局批准的5种治疗AD的药物，4种是胆碱酯酶抑制剂，第5种是NMDA受体阻滞剂，它们只能短期改善症状，但不能延缓疾病进展[1]。AD的新药仍在不断研发过程中，候选药物多针对单一靶标或单一疾病相关途径，至今未取得突破性成果[2]。AD是一种复杂的疾病，存在多个层次相互作用(基因、蛋白、细胞器、细胞、组织、整个机体、外环境)，因此药物-蛋白作用的网络模型更优于线性的药物-蛋白模型，是AD药物研发的新思路[3-4]。

中医认为，AD的发生与肾虚有密切关系，肾亏之年，精髓乏源，髓海失养，神机失用，发为痴呆。同时老年脏腑虚衰，生理或病理产物不能及时排除，蓄积体内，生痰生瘀，痰浊蒙壳、瘀阻脑络，使脑气与脏器不相连接，神机失用，便发痴呆。中药防治AD取得一定疗效，田金洲教授临床治疗AD取得一定疗效，其团队历时24个月的研究表明，中药联合AD常规治疗患者MMSE评分显著优于AD常规治疗[5]。其中药方剂的核心药物组成：人参、淫羊藿、远志、郁金已申请通过国家专利(专利号：ZL2008100067.33.0)，命名为补肾方。补肾方治疗AD的生物学基础与分子机制尚待进一步研究。

网络药理学是人工智能和大数据时代背景下一门新兴、交叉、前沿的学科，已被广泛应用于中医药领域，其系统性及整体性的研究特点，在一定程度上解决了单靶点机制通路的研究方法难以解释中药多成分、多靶点协同作用的问题，使中药药物研发具有可预测性，为中医从经验医学转化为循证医学提供新的范例[6-7]。据此，本研究根据世界中医药学会联合会发布的Network Pharmacology Evaluation Method Guidance-Draft[8]，探讨补肾方治疗AD的潜在作用机制。

1 资料与方法

1.1 补肾方主要活性化合物的筛选及作用靶点的确定 本研究依托中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)和中药分子机制生物信息学分析工具BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org)检索人参、淫羊藿、郁金、远志的主要活性化合物。本研究设置口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、类药性(Drug Likeness，DL)≥0.18对化合物进行筛选。利用数据库查询主要活性化合物的作用靶点，其中BATMAN-TCM分析平台靶点获取设置条件阈值(Prediction Score Cutoff)>20。随后利用Uniprot数据库(https://uniprot.org/)将靶蛋白名转换为标准基因名，得到化合物对应关键靶点的基因。

1.2 阿尔茨海默病靶点的收集及潜在靶点预测 使用GeneCard(https://www.genecards.org/)数据库，以“Alzheimer Diease”为关键词检索AD相关基因，该库集成了约150个网络来源的基因数据，每个基因名称有AD相关证据，Score值越高则代表靶点与疾病关系越密切，根据经验，若靶点过多，设置Score>30。使用Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在线工具,将药物预测的靶点与疾病的靶点进行映射，获得补肾方治疗AD的潜在靶点。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)网络、药物-化合物-作用靶点-疾病网络的构建 将药物和疾病相映射得到的48个交集基因在STRING平台进行PPI网络分析，将数据导入Cytoscape 3.7.2得到PPI网络，节点越大，颜色越深，表明度值越大，每条边则表示蛋白与蛋白之间的相互作用，线条越多表示关联度越大。

将潜在靶点通过STRING数据库(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins，https://string-db.org/)构建靶标PPI网络。利用Cytoscape 3.7.1软件(http://www.cytoscape.org/)构建药物-化合物-作用靶点-疾病网络。

1.4 靶点功能富集分析 将核心靶点基因进行功能富集和主要作用通路分析，使用Metascape平台(https://metascape.org/)，以P<0.01进行基因本体(Gene Ontology，GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析，筛选排名靠前的生物过程和通路，并对富集分析结果进行可视化处理。GO注释分析是指通过相同的语义描述基因生物学功能的项目，包含细胞成分(Cell Components，CC)、分子功能(Molecular Function，MF)和生物过程(Biological Process，BP)3部分。

2 结果

2.1 补肾方主要活性化合物及其作用靶点 按照筛选条件，得到人参化学成分22个，淫羊藿化学成分23个，郁金化学成分15个，远志化学成分31个。删除重复、冗杂以及未找到靶点的化合物，最终共获得45个化合物，利用数据库查询主要化合物调控的靶点信息，共筛选出对应的作用靶点397个。最后通过Uniprot对靶点和基因信息进行标准化。

2.2 补肾方治疗AD的潜在靶点 从GeneCards数据库中检索到AD的潜在靶点，根据经验设置Score>30的靶点为AD的潜在靶点，共得到282个靶点。运用Venny 2.1在线工具，将补肾方主要活性成分调控的靶点与AD的疾病靶点取交集，最终得到交集靶点48个。见图1。

图1 补肾方-阿尔茨海默病靶点韦恩图

2.3 补肾方治疗AD潜在靶点PPI网络构建 PPI网络包含48个节点和513条边，其中节点表示蛋白，度值表示连接到1个节点的线条数。靶蛋白平均节点度值为21.4，超过平均度值的靶点26个。AKT1、IL-6、CASP3、TNF、TP53、VEGFA、MAPK1、PTGS2、IL1B、CCL2、EGF、APP、CXCL8度值显著高于其余靶点，在PPI网络中起着重要的联系作用。其中，AKT1的节点最大，颜色最深，可能是补肾方治疗AD最主要的潜在靶点。见图2。

图2 补肾方与AD交集靶点的PPI网络

2.4 药物-化合物-作用靶点-疾病网络 运用Cytoscape 3.7.1软件构建药物-化合物-作用靶点-疾病网络，网络包含30个化合物，48个靶点，1个疾病。红色节点代表疾病，蓝色代表靶点，橙色代表药物名称，淡黄色代表人参的活性成分，淡绿色代表淫羊藿的活性成分，淡紫色代表远志的活性成分，淡蓝色代表人参与淫羊藿共有的活性成分，淡粉色代表郁金与人参共有的活性成分，每条边表示化合物和靶点之间相互作用的关系。根据节点度值等网络拓扑学特征进行核心节点的筛选。结果显示，槲皮素、山柰酚、木犀草素、脱水淫羊藿素、人参皂苷等化合物在整个网络中发挥着关键作用，可能是补肾方治疗AD的核心化合物。见图3。药物、成分对应标记名称见表1。

表1 补肾方主要成分

图3 药物-化合物-作用靶点-疾病网络

2.5 靶点通路分析 通过Metescape数据库进行GO功能富集分析，得到BP条目1 077条(P<0.05)。其中，神经递质代谢过程(Neurotransmitter metabolic process)、细胞因子介导信号通路(Cytokine-mediated signaling pathway)、对无机物的反应(Response to inorganic substance)、对脂多糖的反应(Response to lipopolysaccharide)、细胞增殖的负调节(Negative regulation of cell proliferation)、小分子代谢过程的调节(Regulation of small molecule metabolic process)、管制囊泡介导的运输细胞迁移的积极调节(Regulation of vesicle-mediated transport)、细胞对有机循环化合物的反应(Cellular response to organic cyclic compound)、代谢过程受体(Receptor metabolic process)、细胞对氮化合物的反应(Cellular response to nitrogen compound)、细胞对药物的反应(Cellular response to drug)、细胞对氧气水平的反应(Response to oxygen levels)、循环系统中的血管过程(Vascular process in circulatory system)、细胞分化的负调节(Negative regulation of cell differentiation)、血管发育(Blood vessel development)、腺体发育(Gland development)、化学突触传播的调节(Modulation of chemical synaptic transmission)、神经元死亡(Neuron death)、细胞黏附调节(Regulation of cell adhesion)等BP中，靶点较集中。这提示补肾方活性化合物通过调控多种生物学途径对AD产生影响。将排名前20的GO条目绘制柱状图。见图4。

图4 补肾方主要成分潜在靶点GO-BP分析

KEGG通路富集分析筛选出128条信号通路(P<0.01)，选取P值较小的16条通路(图5)。这些基因数目在IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、结核病(Tuberculosis)、肿瘤(Pathways in cancer)、流体剪切应力与动脉硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、血清素能突触(Serotonergic synapse)、多巴胺能突触(Dopaminergic synapse)、T细胞受体信号通路(T cell receptor signaling pathway)、阿尔茨海默病(Alzheimer disease)、胰岛素抵抗(Insulin resistance)、核因子κB信号通路(NF-kappa B signaling pathway)、钙信号通路(Calcium signaling pathway)、产生IgA的肠道免疫网络(Intestinal immune network for IgA production)等通路上富集较多。将排名前16的KEGG条目绘制柱状图。见图5。

图5 补肾方主要成分潜在靶点KEGG分析

3 讨论

补肾方由淫羊藿、人参、远志、郁金4味中药组成，将补肾、益气、化痰、活血治法中各具代表性的中药组成本方，具有标本兼治，扶正祛邪的作用。前期研究发现，与模型组比较，补肾方能改善AD模型鼠学习记忆行为，减轻AD病理学改变、胆碱酯酶、糖原核酶激酶3β表达水平，提高蛋白磷酸酶2A表达水平，改善突触结构，增加脑内葡萄糖转运、调控胰岛素信号通路[9-14]。本研究采用网络药理学方法构建补肾方的“药物-化合物-作用靶点-疾病”网络，得到29个活性化合物，48个潜在靶点，188条潜在通路，进一步挖掘补肾方的潜在作用靶点，与实验研究相互补充验证。

本研究筛选出几个重要成分，在活性化合物中，槲皮素综合评分远高于其他化合物，存在于淫羊藿中。槲皮素是一种黄酮类化合物，在神经退行性疾病中具有神经保护作用。槲皮素对AD的神经保护作用包括拮抗β淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)的毒性作用，一项体外研究发现，槲皮素抑制Aβ纤维聚集并破坏成熟的纤维[15]；使用槲皮素预处理过的原代海马神经元，Aβ1-42的神经毒性作用更小[16]。槲皮素可能通过PI3K/AKT/GSK3β通路抑制Tau过度磷酸化，减轻神经病理[17]。槲皮素具有抗神经炎症的作用，能下调衰老小鼠海马组织炎症介质表达水平，改善小鼠空间学习能力[18]。此外既往研究还发现槲皮素能保护神经元免受氧化应激和兴奋性毒性的损害,改善胆碱能功能并在AD中起神经保护剂等作用[19-20]。山柰酚存在于人参和淫羊藿中，作为另一种黄酮类化合物，其能降低AD模型果蝇氧化应激水平和乙酰胆碱酯酶活性，可能对AD治疗有一定作用[21]。木犀草素是一种植物雌激素，研究发现，木犀草素对Aβ25-35损伤PC12细胞具有保护作用[22]。

将补肾方主要活性成分调控的靶点与AD的治疗靶点取交集，得到48个关键靶点，其中AKT1度值最大，可能是补肾方治疗AD最主要的潜在靶点。AKT1基因编码的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT1，在蛋白质合成通路、细胞凋亡过程中起关键作用。AKT1中的rs2498786启动子多态性与患有2型糖尿病及不患有2型糖尿病的中国汉族人群AD发病风险有关[23]。AKT1参与特定区域(AT100表位)的tau磷酸化[24]。AKT通过介导的信号通路AKT/GSK3β在AD发病中发挥作用[25]。既往研究发现补肾方中的成分可能通过作用于AKT1，调节其下游蛋白糖原合酶激酶3(Glycogen Synthase Kinase-3，GSK-3)，从而抑制Aβ沉积及神经纤维缠节的形成，从疾病通路的上游进行干预，保护神经元免于凋亡[26-27]。

GO功能富集分析得到生物过程GO条目1 077个(P<0.01)，KEGG通路富集分析筛选得到128条信号通路(P<0.01)。GO富集分析涉及神经递质代谢过程、细胞因子介导信号通路、循环系统中的血管过程、化学突触传播的调节、神经元死亡等生物过程。

KEGG通路富集分析显示，潜在靶点主要参与的流体剪切应力与动脉硬化通路、胰岛素抵抗通路等，与现有的AD发病机制报道相吻合。近年来研究发现，胰岛素可从外周穿越血脑屏障，介导神经递质在突触间传递，调节神经元和神经胶质细胞代谢，以及大脑中的神经炎症反应[28]。因此，作用于胰岛素抵抗通路是防治AD的新策略。研究表明，鼻内胰岛素给药可改善2型糖尿病患者、肥胖患者或健康人群的记忆力及其他认知功能。补肾方中的成分可能作用于胰岛素抵抗通路防治AD[29-31]。

动脉粥样硬化是一种慢性综合征，会影响血管(包括脑血管)结构和功能的完整性，从而导致脑血管功能障碍[32]。研究发现，在Aβ沉积、tau过度磷酸化、神经元损伤这些AD经典的病理特征出现之前，AD早期就出现神经血管功能障碍[33]。由于神经血管功能紊乱，脑血流对神经活动调节受损，从而导致神经活动与所需要的氧气和葡萄糖供应不相匹配，因此脑功能受损，临床表现为认知功能下降。补肾方可能通过流体剪切应力与动脉硬化通路调节脑血流量，保护脑血管，从而对疾病的早期进行干预。

另外，其他通路也发挥着重要作用，例如HIF-1信号通路参与调解AD病情中的氧化应激及线粒体功能障碍[34]。血清素能突触通路参与学习、记忆、情绪、睡眠等多个生理过程，与AD密切相关[35]。

以上分析了补肾方治疗AD有效成分及作用靶点、信号通路。可以看出，补肾方治疗AD形成多靶点、多通路、多途径协同作用网络，并且可以推测槲皮素、山柰酚、木犀草素、脱水淫羊藿素、人参皂苷是其中重要的有效成分。AKT1、IL-6、CASP3、TNF、TP53是其比较重要的作用靶点。相关干预AD通路的机制主要包括：下调神经炎症反应、防止蛋白质错误折叠、改善血管神经功能障碍、影响神经递质、调节细胞代谢及线粒体功能等，并可以在疾病的早期、信号通路的上游进行干预。但由于目前对槲皮素、山柰酚、木犀草素的研究相对较多，因此本研究在线工具数据分析的结果可能出现一些偏倚，导致一些更重要的成分或者信号通路或许未能显示[36]。由于中药方剂不是化学成分的简单叠加，药效受中药成分含量的影响，且中医讲究辨证论治，目前疾病靶点数据库是针对西医疾病名称，而不是中医病证，因此本研究具有一定局限性[37]。

综上所述，本研究从系统网络的角度探究补肾方治疗阿尔茨海默病的机制，为进一步实验研究奠定基础，但需要今后进一步研究与验证。