烟草五种土传病原菌的多重PCR快速检测

舒芳玲，范东升，张得平，蓝达愉，林纬，卢燕回，袁高庆*

植物保护

烟草五种土传病原菌的多重PCR快速检测

舒芳玲1，范东升2，张得平2，蓝达愉1，林纬1，卢燕回2，袁高庆1*

1 广西大学农学院，南宁 530004；2 中国烟草总公司广西壮族自治区公司，南宁 530022

【目的】建立一种可同时检测烟草黑胫病菌（）、青枯病菌（）、立枯病菌（）、根腐病菌（）和根黑腐病菌（）5种烟草重要土传病原菌的五重PCR快速检测方法。【方法】筛选5种病原菌的特异性引物组合，通过不同的引物浓度和退火温度对多重PCR体系进行优化，检测体系的灵敏度，并对土壤和植株样品进行测试，验证其实用性。【结果】根据青枯病菌基因、立枯病菌基因、根腐病菌基因以及根黑腐病菌基因设计特异性引物，并结合已报道的黑胫病菌基因的特异性引物，成功建立5种烟草土传病害的多重PCR检测方法。反应体系（25 µL）：Sf1/Sr1、Ff1/Fr1、Pf1/Pr1每条引物分别0.3 µL，Rf1/Rr1每条引物各1.8 µL，TBf1/TBr1每条引物各1 µL，2×PCR Mix 12.5 µL，退火温度为58℃，灵敏度可达到100 pg/µL。【结论】本研究建立的多重PCR体系能够同时快速检测烟草黑胫病菌、青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌和根黑腐病菌以及田间带菌烟草病株和土壤，为田间烟草土传病害的早期诊断提供依据。

烟草；土传病害；分子检测；五重PCR

烟草易受多种病害的威胁，其中土传病害危害严重，导致烟草的产量和品质下降，严重影响我国烟草产业的发展。分布较广的重要烟草土传病害包括烟草疫霉（）引起的黑胫病[1]、茄科雷尔氏菌（）引起的青枯病[2]、立枯丝核菌（）引起的立枯病[3]、尖孢镰刀菌（）引起的根腐病[4]以及基生根串珠霉（）引起的根黑腐病[5]等，这5种病害发病早期隐蔽性强，待症状显现时多已难以救治。另外，土传病害易发生复合侵染，增加病害诊断和防治的难度。因此，建立一种能在早期对多种烟草土传病原菌进行快速、准确、高效的检测方法，有助于降低烟草土传病害带来的严重损失。常规检测方法主要是对病株进行分离鉴定，其分离难度大、灵敏度低、耗时长，难以满足生产上的需求。血清学检测易出现假阳性反应且一次只能检测一种病原。近年来，随着分子生物学的发展，已有很多PCR相关技术运用在植物病害的快速检测方面。如Li等[6]利用环介导等温技术扩增实现了对茄科雷尔氏菌的快速分子鉴定。Tsai等[7]利用巢式PCR实现了对烟草疫霉的快速鉴定。Mette等[8]利用UP-PCR分子技术实现了对立枯丝核菌的快速鉴定。Ling等[9]利用比较基因组学的方法，建立了尖孢镰刀菌的多重PCR检测体系。Liu等[10]利用多重PCR技术实现了对烟草疫霉和烟草根腐病的快速检测。田间烟草土传病原菌种类较多，建立同时检测更多病原菌种类的技术将提高检测效率和应用价值。本研究拟通过设计烟草黑胫病菌、青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌和根黑腐病菌的特异性引物，优化多重PCR扩增体系，验证检测方法的特异性、灵敏度和实用性，实现烟草重要土传病害的五重PCR快速检测。

1 材料与方法

1.1 材料

供试病原菌：烟草疫霉（）、茄科雷尔氏菌（）、立枯丝核菌（）（AG-2）、灰葡萄孢（）、茄病镰刀菌（）、终极腐霉（）、胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（）、丁香假单胞菌（）由广西大学农学院提供；尖孢镰刀菌（）由河南省农业科学院烟草研究所提供；基生根串珠霉（）由安徽农业大学植物保护学院提供。

试剂：PCR反应液MasterMix（2×）购自南宁市拓普邦生物科技有限公司，DNA Marker B（100-600）、Ezup柱式细菌DNA抽提试剂盒购自上海生工生物工程（上海）股份有限公司。Biospin真菌DNA提取试剂盒、Biospin全能型植物DNA提取试剂盒以及BioFast土壤DNA提取试剂盒购自杭州博日科技股份有限公司。

供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基、马铃薯葡萄糖（PDB）培养液、燕麦琼脂（OMA）培养基和V8汁琼脂（V8）培养基[11]，以上培养基均调至pH7。

供试烟草品种为云烟87，由广西壮族自治区烟草公司贺州市公司提供。

1.2 DNA的提取

将烟草立枯病菌和根腐病菌以及对照菌终极腐霉、灰葡萄孢和茄病镰刀菌分别接种于PDA培养基上，烟草根黑腐病菌接种于V8培养基上，烟草黑胫病菌接种于OMA培养基上，28℃培养5 d后，收集菌丝，按照真菌DNA提取试剂盒说明提取DNA；将烟草青枯病菌以及对照菌胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种和丁香假单胞菌接种于NB培养液28℃下180 r/min振荡培养24 h，收集菌体，按照细菌DNA试剂盒说明提取DNA；植株和土壤样品分别按照植株DNA提取试剂盒和土壤DNA提取试剂盒提取DNA；DNA浓度采用DeNOVIX仪器测定。

1.3 五种目标病原菌菌株的验证

利用真菌通用引物ITS4和ITS5扩增烟草黑胫病菌、立枯病菌、根腐病菌以及根黑腐病菌的ITS序列；利用细菌通用引物16s-63F和16s-1387R扩增青枯病菌的16S rDNA序列，将所得到的PCR产物送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果在NCBI中进行同源性比较。烟草黑胫病菌、立枯病菌和根腐病菌分别接种于PDB培养液28℃下180 r/min振荡培养10 d；烟草根黑腐病菌接种于V8培养基上，28℃培养7 d；烟草青枯病菌接种于NB培养液28℃下180 r/min振荡培养1 d。将烟草黑胫病菌和立枯病菌的菌丝打碎，配成8 mg/mL的菌丝悬液；烟草根腐病菌和根黑腐病菌通过血球计数板配成107个孢子/mL的孢子悬浮液；烟草青枯病菌通过分光光度计配成2×108CFU/mL的菌液。培育烟草苗龄40 d，除用于烟草立枯病菌接种的烟草为茎基部刺伤处理外，其他4种病原菌接种的烟草为伤根处理，再通过灌根法分别接种，对5种目标病原菌菌株进行致病性测定。

1.4 引物设计与合成

根据烟草青枯病菌的基因（GenBank登录号LC102464）、立枯病菌的基因（GenBank登录号MT150070）、根腐病菌的基因（GenBank登录号FJ590533）以及根黑腐病菌的基因（GenBank登录号HM569628），应用Primer 6.0设计引物，黑胫病菌采用基于基因设计的特异性引物[12]，引物由南宁捷尼斯生物科技有限公司合成，引物序列如表1。本研究所使用的引物浓度均先稀释为10 µmol/L，然后在PCR反应体系中加入相应体积的该浓度的引物。

表1 PCR特异性引物

Tab.1 PCR specific primers

1.5 单重PCR特异性检测

以5种目标病原菌基因组DNA为模板，分别以常见的土传病原菌终极腐霉、灰葡萄孢、茄病镰刀菌、胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种和丁香假单胞菌等非目标病菌基因组DNA及ddH2O为阴性对照，检测设计的5对引物的特异性。PCR反应体系（25 µL）：2×PCR Mix 12.5 µL，引物各1 µL，DNA模板1 µL，加ddH2O补足25 µL。PCR反应程序：94℃5 min，94℃30 s，58℃30 s，72℃3 0 s；循环30次；72℃10 min。并利用Clone Manager对引物进行比对进一步验证引物特异性。

1.6 多重PCR反应体系的建立及条件优化

在常规PCR反应的基础上，同时加入5种目标病原菌的基因组DNA和特异性引物，对影响多重PCR扩增的重要因素进行优化。引物用量设置如表2，不同反应体系中分别加入相应体积的每条引物。退火温度分别设置为52℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、62℃、64℃。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶成像仪进行拍照，筛选出最佳PCR体系。

表2 多重PCR反应体系中引物体积及终浓度

Tab.2 Volume and concentration of primers used in multiplex PCR

1.7 多重PCR特异性验证

采用设计的5对引物优化的PCR体系，分别加入一种及多种目标病原菌DNA组合验证多重PCR特异性。

1.8 多重PCR灵敏度检测

烟草青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌、根黑腐病菌及黑胫病菌的基因组DNA提取物的浓度分别为114 ng/µL、159 ng/µL、172 ng/µL、129 ng/µL、183 ng/µL。使用DeNOVIX仪器将其浓度调至100 ng/µL，然后进行2～10倍梯度稀释，共6个梯度（10 ng 、1 ng、500 pg、100 pg、10 pg、1 pg），以5种病原菌10 ng～1 pg范围内的基因组DNA作为模板，分别加入5种病原菌及其引物进行单重PCR扩增。PCR反应体系（25 µL）：2×PCR Mix 12.5 µL，DNA模板 1 µL，引物各1 µL，ddH2O 9.5 µL。再以5种病原菌10 ng～1 pg范围内的基因组DNA为模板，每个反应中加入5种病原菌的基因组DNA和5对引物，多重PCR反应体系（25 µL）：2×PCR Mix 12.5 µL，5种DNA模板各1 µL，引物Sf1/Sr1、Ff1/Fr1、Pf1/Pr1各0.3 µL、Rf1/Rr1各1.8 µL、TBf1/TBr1各1 µL，加ddH2O补足25 µL。按照优化的PCR程序进行扩增。

1.9 带菌土壤和植株样品的多重PCR检测

1.9.1 人工接种样品的多重PCR检测

在种植烟草的田块采集土壤，置于121℃下湿热灭菌30 min，分别将烟草黑胫病菌、青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌和根黑腐病菌单独和混合后加入土壤中，得到人工接种的阳性土壤样品，灭菌后的田间土壤样品为阴性土壤样品。另外按照1.3中的方法将以上5种病菌分别接种至烟株上，待发病后将单独采集的病组织和混合的病组织作为人工接种的阳性植株样品，健康烟株组织为阴性植株样品。采用土壤DNA提取试剂盒和植株DNA提取试剂盒分别提取土壤和植株样品DNA。按照优化PCR反应体系进行多重扩增。

1.9.2 田间样品的多重PCR检测

从广西贺州市、靖西市、广西大学农科基地随机采集烟田根系周围的土壤，并对表现局部或全株萎蔫的烟株，采集根茎部或茎基部或茎干维管束呈现褐变的组织，阴性对照为广西大学玻璃温室的健康烟株。对田间采集的9份烟田土壤和12份烟草病株样品以及对照，采用土壤DNA提取试剂盒和植株DNA提取试剂盒分别提取烟田土壤和烟株DNA，采用本研究建立的多重PCR体系，对田间样品进行五重PCR检测。

2 结果和分析

2.1 目标菌株的验证

ITS扩增的烟草黑胫病菌、根腐病菌、根黑腐病菌、立枯病菌与16S rDNA扩增青枯病菌的PCR产物经测序后，在NCBI网站上的GenBank同源性比对结果显示，其与相对应病原菌的同源性都达到100%。致病性测定结果表明，这5种病原菌均可使烟草发生相应病害。说明供检测的目标病原菌鉴定无误。

2.2 单重PCR特异性验证结果

如图1所示，以5种病原菌的DNA作为模板，用相应的引物经PCR扩增分别得到424 bp、316 bp、219 bp、139 bp、110 bp的特异性条带，与预期片段一致，而在胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种、丁香假单胞菌、灰葡萄孢、茄病镰刀菌、终极腐霉等非目标病菌和阴性对照中均未能扩增出条带。说明引物特异性高，可用于多重PCR检测。利用Clone Manager引物比对结果显示设计的引物均只能在该病原菌全基因组上找到位点。

注：A-E：泳道1-10：依次为茄科雷尔氏菌、立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、基生根串珠霉、烟草疫霉、胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种、丁香假单胞菌、灰葡萄孢、茄病镰刀菌和终极腐霉，A-E代表以上每种病原菌DNA模板中分别加入引物Sf1/Sr1、Rf1/Rr1、Ff1/Fr1、Tbf1/Tbr1和Pf1/Pr1；F：泳道1-5：ddH2O中分别加入引物Sf1/Sr1、Rf1/Rr1、Ff1/Fr1、Tbf1/Tbr1和Pf1/Pr1。

2.3 多重PCR反应体系的建立及条件优化结果

引物用量会影响多重PCR的扩增效率，如图2的1泳道所示，当引物浓度一样，立枯病菌和根黑腐病菌无目标条带，通过逐渐降低青枯病菌、根腐病菌以及黑胫病菌的引物用量，同时增加立枯病菌引物用量，立枯病菌和根黑腐病菌条带逐渐清晰，结果如图2的8泳道所示，当Sf1/Sr1、Ff1/Fr1、Pf1/Pr1各0.3 µL，Rf1/Rr1各1.8 µL，TBf1/TBr1各1 µL时，能获得5条清晰的条带，应为最佳引物浓度。此外，如图3所示，退火温度从52℃到62℃均可扩增出5条条带，55℃到58℃时条带清晰；当退火温度≥64℃时，多重PCR已不能扩增出青枯病菌和根腐病菌的目的条带。综合引物特异性和条带清晰度，本研究设定58℃为最佳退火温度。

图2 多重PCR引物浓度的优化

注：泳道1-10：退火温度：52℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、62℃、64℃。

2.4 多重PCR特异性验证结果

如图4所示，多重PCR反应随机扩增以及这5种病原菌，均能扩增得到与目标片段大小一致的条带，说明这5对引物之间不会互相产生影响，检测特异性强。

注：A：泳道1-5：依次为烟草疫霉、基生根串珠霉、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌和茄科雷尔氏菌；B：泳道1-3：两种不同病原菌的组合；泳道4和5：三种不同病原菌的组合；泳道6和7：四种不同病原菌的组合；泳道8：5种不同病原菌的组合；N：ddH2O。

2.5 多重PCR灵敏度检测结果

单重PCR灵敏度检测结果如图5A-E所示，烟草青枯病菌和根腐病菌的检测极限为10 pg/µL，立枯病菌、根黑腐病菌和黑胫病菌的检测极限为100 pg/µL。多重PCR灵敏度检测结果如图5F所示，与单重PCR相比，青枯病菌的检测极限降低了一个数量级，立枯病菌、根腐病菌、根黑腐和黑胫病菌的检测极限与单重PCR的一致，能够同时检测到5种病原菌的灵敏度为100 pg/µL。

注：A-E：单重PCR中对引物Sf1/Sr1、Rf1/Rr1、Ff1/Fr1、Tbf1/Tbr1和Pf1/Pr1进行单独的灵敏度测定；F：多重PCR的灵敏度测定；A-C：泳道1-5：基因组浓度分别为10 ng/µL、1 ng/µL、100 pg/µL、10 pg/µL、1 pg/µL；D-F：泳道1-6：基因组浓度分别为10 ng/µL、1 ng/µL、500 pg/µL、100 pg/µL、10 pg/µL、1 pg/µL。

2.6 人工接种样品的多重PCR检测结果

人工接种土壤和植株样品检测结果如图6所示，阳性土壤和植株样品均能扩增出目的条带，阴性土壤和植株样品无条带。表明本研究建立的多重PCR方法可应用于后续田间样品检测。

注：A为人工接种的阳性土壤样品，其中泳道1为五重阳性对照，泳道2为阴性土壤样品，泳道3-8为阳性土壤样品；B为人工接种的阳性植株样品，其中泳道1为五重阳性对照，泳道2为健康烟草植株样品，泳道3-8为阳性植株样品。

2.7 田间样品的多重PCR检测结果

如图7所示，在田间采集的9份土壤和12份发病烟株样品中，6份土壤和8份病株样品中检测出青枯病菌，1份植株样品中检测出立枯病菌，1份土壤和7份病株样品检测出根腐病菌，1份土壤样品中检测出根黑腐病菌，3份病株样品中检测出黑胫病菌，2份土壤中未见目标菌，检测结果与分离培养结果相吻合。通过检测发现，田间存在2种甚至3种土传病原菌复合侵染现象。因此，本研究建立的多重PCR体系可用于田间烟草青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌、根黑腐病菌以及黑胫病菌的快速检测。

注：A：贺州市样品；B：靖西市样品；C：广西大学农科基地样品；泳道1：五重阳性对照；泳道2：健康烟草植株；泳道3-5：土壤样品；泳道6-9：植株样品。

3 讨论

多重PCR技术是在同一反应体系中加入多对特异性引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其原理与常规PCR相同。在病害研究中，主要应用于多种病原物的同步检测。与常规PCR相比，多重PCR具有成本低、检测效率高等优点[13]。目前运用多重PCR检测烟草病原菌的研究中，陆星星等报道了烟草黑胫病菌、根黑腐病菌和根腐病菌的多重PCR检测[14]。刘萍花等开展了烟草黑胫病菌、根黑腐病菌、猝倒病菌及立枯病菌的多重PCR检测[15]。张丽芳等建立了能够同步检测烟草青枯病菌、黑胫病菌和猝倒病菌的多重PCR检测[16]。但不同烟草种植区域病害种类有所不同，病原菌分布不一致，需要根据当地病害发生情况设计相应病原菌组合的多重PCR体系。广西高温高湿的气候特点有利于多种烟草土传病害的发生，以黑胫病和青枯病为主，立枯病、根腐病、根黑腐病等在局部区域分布。本研究建立了一种同时检测更多病原菌种类的多重PCR方法，能够同时检测田间病株和土壤中烟草黑胫病菌、青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌和根黑腐病菌，进一步提高了检测效率，并能更好地服务于当地烟草农业生产。

多重PCR分子检测技术中，引物的特异性、引物浓度、反应条件的退火温度等都对多重PCR扩增结果有很大影响。为每个目的病原菌设计出特异性引物，保证各病原菌引物之间没有交叉反应是成功的关键[17]。引物的选择不仅影响多重PCR扩增的特异性，还影响多重PCR检测的灵敏度。应选择高度保守基因，保证所设计的引物具有种间特异性和种内通用性的特点，避免因种内不同菌株间变异引起的检测难题。但由于物种之间的16S rDNA或ITS序列相似度能高达98%以上，因此相近物种之间可能会出现假阳性。茄科雷尔氏菌基因序列因其高度保守的特点，被广泛应用于土壤中青枯菌的检测[18]。立枯丝核菌基因中的内含子较少，在位置上也高度保守，与ITS相比具有更高的系统发育信息，曾被用来研究丝核菌属的系统发育关系[19]。尖孢镰刀菌基因能够很好保证种间特异性，又能兼具种间通用性，张阳等利用基因设计尖孢镰刀菌特异性引物建立了草莓根腐病的多重PCR检测体系[20]。根串珠霉基因及表达调控在不同物种间都具有高度保守性，曾被用来研究烟草根黑腐菌的遗传多样性分析[21]。烟草疫霉基因在进化上高度保守，潘明森等利用基因设计引物，实现了对土壤中烟草黑胫病菌的定量检测[12]。其次，引物扩增片段的大小应存在一定差异，便于区分。本研究通过对引物的筛选，最后根据烟草青枯病菌的基因、烟草立枯病菌的基因、烟草根腐病菌的基因、烟草根黑腐病菌的基因分别设计了引物，并结合潘明森等报道的烟草黑胫病菌基因的特异性引物，筛选出最适合多重PCR的引物组合。除引物设计外，引物浓度对多重PCR扩增也很重要，必须保证所有的引物具有相似的扩增效率[22]。本研究首先针对每对引物选定同样的用量，后根据各对引物扩增的效率逐渐调整引物用量，最终使每对引物对各自目标具有同样的扩增效率，成功建立烟草土传病害的五重PCR体系。退火温度对多重PCR扩增质量影响也很大，合适的退火温度可以保证引物的特异性以及条带的清晰度，在条带清晰的基础上选择较高的退火温度，这样只有匹配程度高的碱基才能结合到模板上，检测特异性越强[23]。已报道烟草病菌四重和三重PCR体系中的退火温度分别为56℃和61℃[15-16]，本文选择的退火温度为58℃。另外，本研究建立的多重PCR体系对混合DNA检测的灵敏度达到了100 pg/µL，高于张丽芳等建立的烟草青枯病、黑胫病和猝倒病的多重PCR检测体系的灵敏度（1.01 ng/µL）。本研究建立的烟草土传病害的五重PCR体系降低了检测的时间和成本，提高了检测的灵敏性。

此外，本试验建立的五重PCR体系还可用于土壤和烟株中这5种病原菌的同步检测，克服了土壤和病害潜伏期及发病初期植株中含菌量低、多种非致病菌干扰等弊端，并且易于发现不同土传病原菌的复合侵染情况，从而为烟草土传病害以及同种病原菌引起的其他作物病害的快速诊断、早期监测预警以及防控提供有力依据。

4 结论

通过引物设计、条件优化和田间应用检验，本研究建立了烟草土传病害的五重PCR检测体系。该体系能够快速、准确地检测田间病株和土壤中的黑胫病菌、青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌以及根黑腐病菌，为烟草土传病害的早期诊断提供了依据。

[1] Zeng J M, Nifong J, Liu Y, et al. Evaluating diverse systems of tobacco genetic resistance toin Yunnan, China[J]. Plant Pathology, 2019, 68(9): 1616-1623.

[2] Hu Y, Li Y, Yang X,et al. Effects of integrated biocontrol on bacterial wilt and rhizosphere bacterial community of tobacco[J]. Scientific Reports, 2021, 11(1): 2653.

[3] Tarantino P, Caiazzo R, Carella A, et al. Control ofin a tobacco-float system using low rates of iprodione- and iprodione-resistant strains of[J]. Crop Protection, 2007, 26(8): 1298-1302.

[4] 于庆涛，姚廷山. 烟草镰刀菌根腐病研究进展[J]. 安徽农业科学，2018, 46(17): 34-36.

YU Qingtao, YAO Tingshan. Advances in tobacoo root rot caused by[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2018, 46(17): 34-36.

[5] 许大凤，王文凤，朱启发，等. 安徽省烟草根黑腐病病原鉴定及生物学特性分析[J]. 烟草科技，2018, 51(8): 27-34.

XU Dafeng, WANG Wenfeng, ZHU Qifa, et alIdentification and biological characterization ofAnhui Province[J]. Tobacco Science and Technology, 2018, 51(8): 27-34.

[6] Li H, Zhang H, Liu Z , et al. Rapid diagnosis ofinfection sweet potato in China by loop-mediated isothermal amplification[J]. Archives of Microbiology, 2021, 203(2): 1-9.

[7] Tsai H L, Huang L C, Ann P J, et al. Detection of orchiddisease by nested PCR[J]. Botanical Studies, 2006, 47(4): 379-387.

[8] Mette L, Hanne P. UP‐PCR cross blot hybridization as a tool for identification of anastomosis groups in thecomplex[J]. FEMS Microbiology Letters, 2001, 201(1): 83-89.

[9] Ling J, Zhang J X, Zeng F, et al.Comparative genomics provide a rapid detection off. sp.[J]. Journal of Integrative Agriculture, 2016, 15(04): 822-831.

[10] Liu N, Jiang S, Feng S, et al. A duplex PCR Assay for rapid detection ofand[J]. The Plant Pathology Journal, 2019, 35(2): 172-177.

[11] 方中达. 植病研究方法（第三版）[M]. 北京：中国农业出版社，1998.

FANG Zhongda. Research methods of plant diseases (The Third Edition)[M]. Beijing: China Agriculture Press, 1998.

[12] 潘明森，王震铄，方敦煌，等. 土壤中黑胫病菌荧光定量PCR快速检测体系的建立及初步应用[J]. 江西农业大学学报，2015, 37(4): 712-718.

PAN Mingshen, WANG Zhenshuo, FANG Dunhuang, et al. Development and preliminary application of fluorescence quantitative PCR system for rapid detection ofin soil[J]. Acta Agriculturae Universitis Jiangxiensis, 2015, 37(4): 712-718.

[13] 杨金广，张帅，申莉莉，等. 烟草中TMV、CMV和PVY多重RT-PCR检测体系的建立与应用[J]. 中国烟草学报，2010, 16(4): 83-88.

YANG Jinguang, ZHANG Shuai, SHEN Lili, et al. Establishment and application of multiple RT-PCR for detection of TMV, CMV and PVY in tobacco[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2010, 16(4): 83-88.

[14] 陆星星，刘伟阳，徐后娟. 烟草三类根腐类病害病原真菌多重PCR检测方法的建立[J]. 山东农业大学学报（自然科学版），2016, 47(4): 520-524.

LU Xingxing, LIU Weiyang, XU Houjuan. Establishment and application of multiplex PCR method for detection of three root rotting fungi on tobacco[J]. Journal of Shandong Agricultural University（Natural Science Edition）, 2016, 47(4): 520-524.

[15] 刘萍花，方敦煌，吴祖建. 应用多重PCR检测烟草黑胫病菌、根黑腐病菌、猝倒病菌及立枯病菌[J]. 福建农林大学学报（自然科学版），2015, 44(4): 345-349.

LIU Pinghua, FANG Dunhuang, WU Zujian. Simultaneous detection of,,andinfected tobacco by multiplex PCR[J]. Journal of Fujian Agriculture and forestry University (Natural Science Edition), 2015, 44(4): 345-349.

[16] 张丽芳，陈海如，方敦煌，等. 烟草青枯病、黑胫病和猝倒病的多重PCR检测[J]. 华北农学报，2013, 28(S1): 22-26.

ZHANG Lifang, CHEN Hairu, FANG Dunhuang, et al. Triplex PCR detection of,andfrom infected tobacco tissues[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica, 2013, 28(S1): 22-26.

[17] Sint D, Raso L, Traugott M. Advances in multiplex PCR: balancing primer efficiencies and improving detection success[J]. Methods in Ecology and Evolution, 2012, 3(5): 898-905.

[18] Schönfeld J, Heuer H, Elsas J V, et al. Specific and sensitive detection ofin soil on the basis of PCR amplification offragments. Applied and Environmental Microbiology. 2003, 69(12):7248-56.

[19] Gónzalez D, Rodriguez-Carres M, Boekhout T, et al. Phylogenetic relationships offungi within the Cantharellales. Fungal Biology. 2016, 120(4): 603-619.

[20] 张阳，刘正坪，高硕，等. 草莓根腐病菌多重PCR检测体系的建立[C]//2015年中国植物病理学会学术年会论文集. 海口：中国植物病理学会，2015.

ZHANG Yang, LIU Zhengping, GAO Shuo, et al. Establishment of multiplex PCR detection system for strawberry root rot pathogen[C]// Proceedings of the Annual Meeting of Chinese Society for Plant Pathology (2015). Haikou: Chinese Society of Plant Pathology, 2015.

[21] 封松利. 河南省烟草黑胫病菌和根黑腐病菌群体遗传多样性分析及分子检测体系的建立[D]. 郑州：河南农业大学，2014.

FENG Songli. population genetic diversity and molecular detection ofandin Henan province[D]. Henan Agricultural University, 2014.

[22] Markoulatos P, Siafakas N, Moncany M. Multiplex polymerase chain reaction: a practical approach[J]. Journal of Clinical Laboratory Analysis, 2002, 16(1): 47-51.

[23] 张杨，张朝贤，王金信，等. 牛筋草ISSR-PCR反应体系的建立与优化[J]. 植物保护，2012, 38(3): 90-94.

ZHANG Yang, ZHANG Zhaoxian, WANG Jinxin, et al. Establishment and optimization of TSSR-PCR reaction system for[J]. Plant Protection, 2012, 38(3): 90-94.

Rapid detection of five soil-borne pathogens in tobacco by multiplex PCR

SHU Fangling1, FAN Dongsheng2, ZHANG Deping2, LAN Dayu1, LIN Wei1, LU Yanhui2, YUAN Gaoqing1*

1 College of Agriculture, Guangxi University, Nanning 530004;2 Guangxi Zhuang Autonomous Region Tobacco Company, Nanning 530022

[] The aim of this study was to develop a multiplex PCR assay for simultaneous detection of five important soil-borne pathogens in tobacco, including,,,and. [] Five pairs of specific primers were selected to analyze the influencing factors of five-plex PCR. The primer concentration and annealing temperature were optimized, and the sensitivity of the system was detected. Then the soil and plant samples were tested to verify the utility of the five-plex PCR detection system. [] The primers were designed based on thegene of, thegene of, thegene ofand thegene of. Combined with reported specific primer forgene of, a multiplex PCR detection methods of five soil-borne pathogens of tobacco were successfully established. The reaction system with total volume of 25 μL contained 0.3 µL of Sf1/Sr1, Ff1/Fr1, Pf1/Pr1, 1.8 µL of RF1/Rr1, 1 µL of TBf1/TBr1 respectively, 2×PCR Mix at 12.5 µL. The annealing temperature was 58℃, and the detection limitation was 100 pg/µL. [] The five-plex PCR detection system established in this study can quickly detect,,,,in the infected plant and soil, which provides a basis for early diagnosis and effective control of tobacco soil-borne diseases.

tobacco; soil-borne diseases; molecular detection; five-plex PCR

. Email：ygqtdc@sina.com

舒芳玲，范东升，张得平，等. 烟草五种土传病原菌的多重PCR快速检测[J]. 中国烟草学报，2022，28（5）.

SHU Fangling, FAN Dongsheng, ZHANG Deping, et al. Rapid detection of five soil-borne pathogens in tobacco by multiplex PCR[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2022,28(5).

10.16472/j.chinatobacco. 2022.T0023

中国烟草总公司广西壮族自治区公司科技计划项目“广西烟草重要病害监测及关键技术研究”（202045000020084）

舒芳玲（1996—），硕士研究生，主要研究方向：植物病害的综合防治，Tel：18225839902，Email：2368238770@qq.com

袁高庆（1971—），副教授，Tel：0771-3235612，Email：ygqtdc@sina.com

2022-01-27；

2022-06-21