RBF神经网络与癌细胞黏附度活性检测研究

李 丹

南京中医药大学附属南京医院 南京市第二医院检验科，江苏省南京市 210003

细胞活性评估技术在抗癌新药物测试[1]、细胞毒理学实验[2]以及其他生化反应刺激实验[3]中起着至关重要的作用。传统细胞活性评价方法是细胞计数法[4]，即活细胞占总细胞数量的百分比。然而，由于细胞群体的异质性，传统的细胞计数法已经不能满足药物剂量实验的精度要求。因此，如何评估细胞群体的异质性问题，是本论文需要解决的重要的科学问题。众所周知，细胞与其物理环境之间的黏附作用是发育生物学[5]、组织工程[6]与生物技术过程[7]中的核心，同时细胞黏附性还是细胞转移[8]、细胞活性[9]以及细胞凋亡[10]的物理标志，因此，细胞黏附强度被认为是量化评估细胞状态的重要物理指标之一[11]。通过对细胞黏附性的检测，可实现对细胞状态无标记、非侵入性与实时的监测，因此，本论文考虑将细胞黏附性作为评估细胞异质性的方案。

1 材料与方法

1.1 实验细胞、试剂与装置 人胃癌细胞(SGC-7901)由南京第二医院提供，培养基(DMEM+10% FBS)从美国Gibco公司购买，细胞在37℃，5%CO2环境的水套式二氧化碳培养箱(购买自Heal Force®)内培养。30%浓度的H2O2与纯度65%的顺铂[化学式：PtCl2(NH3)2]试剂购买自MOLBASE公司；CCK-8细胞凋亡检测试剂盒购买自美仑科技公司。

离心机购买自上海卢湘仪离心机仪器有限公司，可调节旋转角速度(ω<10 000rad/min)。微流控芯片由汶灏芯片技术有限公司(中国苏州)制造，如图1所示。离心式微流控芯片采用PDMS材料作为基材，含约105cells/ml细胞密度的培养基滴入芯片的入口，将芯片放入二氧化碳培养箱中培养12h，使细胞在离心式微流控芯片的通道中黏附。

图1 离心式微流控芯片的制作

1.2 实验方法 首先将同一批培养的细胞样本分为样本A和样本B，样本A利用离心式微流控芯片进行细胞黏附脱离实验，样本B在96孔板中进行细胞活性检测实验。两个细胞样本各自分为六组子样本，分别用10μl不同浓度(0、10、50、100、200、500μmol/L)的H2O2培养3h，以建立细胞活性梯度，将滴入0μmol/L H2O2的样本作为控制组。(1)细胞黏附脱离实验：通过改变芯片的转速以改变贴附细胞所受离心力，弱黏附性的细胞会被较弱的离心力脱离，强黏附性的细胞会被较强的离心力脱离，从而建立细胞受离心力影响的黏附脱离动力曲线图。用Origin2016软件对该曲线进行Logistic拟合，得到S型函数f(x)。分别令f(x)=0.2、0.5、0.8，得到细胞黏附强度值τ20、τ50与τ80。(2)细胞活性检测实验是用抗癌药物顺铂进行，将10μl不同浓度(0～300μmol/L)的顺铂试剂滴入96孔板中，培养24h，然后进行CCK-8实验；以顺铂溶液浓度作为x轴，以酶标仪计算的细胞指数作为y轴制作药物剂量反应曲线图(S型曲线)。用Origin2016软件对该曲线进行Logistic拟合，得到S型函数g(x)。令g(x)=0.5，得到细胞活性值IC50。(3)信息融合：将细胞多黏附强度值作为输入，细胞活性值作为输出，利用RBF神经网络建立细胞活性预测模型。

1.3 数据统计分析 所有实验数据均独立重复20次，均具有统计学意义，即P<0.05(n=20)，其中P是指采样误差引起的样品之间的差异。

2 结果

2.1 细胞离心力 本文中利用离心力对群体细胞的异质性等级进行划分，突破了传统的细胞计数方法评估细胞活性的弊端。如图2所示，在离心式微流控芯片环形通道内的细胞平均受力为[12]：

图2 黏附细胞受离心力模型

其中，τ为细胞所受的离心力，r为细胞与芯片中心的距离，ρ为培养基的密度(998.5kg/m3)，μ为培养基黏度(0.085dynes·cm-2·s)[13]，ω为离心式微流控芯片旋转的角速度。

2.2 细胞黏附强度信息提取 细胞在离心式微流控芯片环形通道内培养贴壁，控制转盘转速以改变离心力，每次持续12min，然后对环形通道内的细胞进行计数，除去最初的细胞数量(控制组)得到细胞指数。将得到的数据用Origin2016进行Logistic函数(S型曲线)拟合，得到图3。其中Logistic函数表达式为：

图3 不同活性梯度下离心力对细胞指数的影响

对图3拟合的结果见表1。

表1 Logistic函数拟合参数表

其中，所有拟合的确定系数(R-Square)均>0.99，同时校正确定系数(Adj.R-Square)也均>0.99，说明图3中的曲线达到了很好的拟合。

根据曲线的拟合，可以计算细胞的黏附强度。τN表示细胞脱离(100-N)%所受的离心力，以此来评估细胞群体的黏附强度。然而，用单一参数评估细胞群体的异质性存在一定的误差，因此，提取τ20、τ50与τ80等三个细胞黏附强度参数，并用RBF神经网络来拟合输出(细胞药物反应实验)，以达到精确评估与预测细胞活性的目的，根据公式(2)、图3与表1可计算出τ20、τ50与τ80等三个细胞黏附强度参数。

2.3 细胞活性标定 提高细胞活性评估的准确性，有助于提高新抗癌药物的测试[1]，这也是细胞活性研究领域最重要的目标之一。而细胞活性评估的标准方法，是用抗癌药物对癌细胞进行半抑制率(half maximal inhibitory concentration)IC50的测定[14]。这里，采用顺铂作为药物反应实验的试剂，顺铂主要应用于SGC-7901等肿瘤细胞的治疗[15]。用不同浓度的H2O2在96孔板中制备细胞活性梯度，然后进行药剂反应实验，顺铂浓度范围为(1～300μmol/L)，得到药物反应曲线，如图4所示。用Graphpad Prism 7.0软件可直接计算出IC50的值，具体步骤为：(1)输入数据，点击analyze→ 点击Transform concentration[x]；(2)选择Transform to logarithms；(3)点击analyze→点击Dose-response-Inhibition→点击Log(inhibitor)vs.response-Variable slope(for parameters)。利用该方法计算的IC50的值见表2，作为RBF神经网络的输出。

图4 药物反应实验

表2 IC50的计算

2.4 基于RBF神经网络的细胞活性评估 将细胞黏附强度τ=[τ20、τ50、τ80]作为RBF神经网络的输入，将抗癌药物反应实验的IC50值作为RBF神经网络的输出，调用MATLAB程序：net=newrb(X_train,Y_train, spread)，其中spread为径向基函数的分布密度，这里使spread=1.5。应用训练好的模型对细胞活性进行预测，得到图5，并与传统细胞计数方法进行比较。

由于群体细胞的异质性，以细胞数量作为评价细胞活性的方法会造成药物反应的巨大误差。由图5可知，细胞被不同浓度的H2O2弱化[16]，虽然还是活的细胞，但是其抗药物的能力明显降低。黏附强度作为描述细胞状态强有力的物理参数，通过RBF神经网络将三种黏附强度参数融合在一起，综合评价细胞活性，使得细胞活性得到更精确的评估与预测。结果表明，相比于传统细胞计数法的平均误差19.0%，基于多黏附强度信息融合方法与标准方法IC50法的误差更小，平均误差为1.8%，提高了17.2%，如表3所示。因此，本文提出的细胞活性评估方法，对抗癌新药物测试、细胞毒理学试验以及其他生化刺激的剂量反应试验具有重大意义。

图5 细胞活性评估方法对比

表3 细胞计数法、信息融合法与IC50法比较

3 讨论

细胞的黏附强度是细胞活性重要的物理标志之一，我们制备一种离心式微流控芯片，通过施加不同离心力，同时用细胞计数法统计细胞脱离情况，得到细胞指数与离心力大小之间的曲线关系。结果发现，受较大离心力脱离的细胞都是属于特异性黏附，因为非特异性黏附细胞的黏附状态太弱，易被较弱的离心力冲走，因此表明该项实验具有生物学意义。本文从细胞黏附脱离动态曲线中提取三种黏附强度，表明此方法可以实现细胞群的黏附异质性的评估，且提取的黏附强度参数越多，其表征细胞群黏附强度的梯度越精确。由于细胞所受离心力被位置所限制，因此离心式微流控芯片的通道宽度设计不能超过三个细胞的直径，否则会造成黏附细胞受力不一致；同时，窄通道的设计也有利于细胞计数。另外，细胞对药物的反应能力不只体现在死活上，每个细胞活性状态不一样，因此存在活性异质性问题。结果表明，利用细胞群的多黏附强度信息评估细胞活性，相比于传统仅以死活评价的细胞计数法，其评估细胞药物反应的精确度大大提高。

由于细胞黏附强度的提取需要细胞在微流控芯片中贴壁，贴壁时间大约12h，无法实现细胞活性的快速提取，因此，未来我们将考虑利用缩窄微通道实现单细胞黏附强度的高通量提取，以提升细胞活性评估的效率。另外，虽然本文提取了细胞的多黏附强度信息，但是仍然属于单一的胞外物理特征，将来若结合电化学方法提取细胞膜电容性、胞质浓度或细胞内部电位等信息，并利用深度学习将之融合在一起，则可实现细胞活性更加全面精准的评估。