奶山羊p27基因克隆分析及其对乳腺上皮细胞增殖的影响

岳子婷，黄江涛，宁 勇，宗学阳，张华文，史怀平

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

羊奶因蛋白质、维生素、矿物质、脂肪酸等营养物质丰富以及所含脂肪球较小且易于吸收等优点，得到消费者广泛认可[1]。此外，羊奶还拥有独特的保健功能，对人类营养吸收障碍综合征、小肠功能失调、新生儿营养缺乏症、高血压等代谢疾病具有显著改善作用，是营养、保健的天然饮品[2-3]。随着人们生活水平的提高和对优质奶制品认知的深化，山羊奶越来越受到消费者的青睐。以上市场需求增加了泌乳生物学研究的关注度和必要性。乳腺上皮细胞是乳腺组织泌乳的基本单位，在乳腺组织经历泌乳-退化-泌乳的过程中扮演着重要角色[4],哺乳动物的产奶量在很大程度上受乳腺上皮细胞数量的影响。有研究表明，乳腺上皮细胞的增殖、凋亡受激素、酶、细胞因子等的调节，进而影响到乳腺的发育和功能[5]。探究调控乳腺上皮细胞增殖的分子机制对解析乳腺发育机制和提高动物泌乳性能具有重要意义。

p27基因是近年来发现的一种抑癌基因，其编码的p27蛋白作为细胞周期依赖性激酶抑制因子(cyclin dependent kinase inhibitor，CDKI)成员之一，具有调控细胞周期及各检查点的功能，参与许多细胞内重要生命活动，如细胞凋亡、细胞迁移、细胞转导等[6-7]。已有研究表明，p27蛋白发挥作用的分子机制主要为：在细胞核内与cyclin E-CDK2和cyclin D1-CDK4复合物结合，抑制CDK2和CDK4的蛋白激酶活性，诱导细胞周期停滞在G1期，阻断细胞由静止期向增殖期过渡[8-9]。在正常细胞中，p27基因表达具有严格的调控机制，表达水平受细胞增殖、分化相关信号的影响[8]。而在肿瘤细胞中，p27基因的表达水平较低，减弱了其对细胞周期G1-S和细胞增殖的抑制作用，进而使得肿瘤快速生长[10]。另有研究表明，p27基因在小鼠乳腺正常发育和泌乳过程中有着不可或缺的功能[11-12]。以上研究均证实了p27基因在真核细胞增殖和细胞周期调控中的关键作用。

目前，有关p27基因调控奶山羊乳腺发育的研究鲜有报道。本文以西农萨能奶山羊乳腺组织为实验材料，通过克隆p27基因CDS区，对其编码区进行生物信息学分析，并利用分子手段调控其在乳腺上皮细胞中的表达，初步探讨p27基因对奶山羊乳腺上皮细胞增殖的影响机制。

1 材料与方法

1.1 样品采集

在西北农林科技大学萨能羊原种场选择健康并分别处于泌乳前期、泌乳盛期、泌乳后期、干奶期的西农萨能奶山羊母羊各3只。利用普鲁卡因对羊乳腺进行局部麻醉，手术采集乳腺组织1～2 g，液氮保存，用于组织总RNA提取。本动物实验在西北农林科技大学实验动物伦理委员会的指导下开展。

1.2 主要试剂

奶山羊原代乳腺上皮细胞由本实验室保存。大肠杆菌TOP10感受态细胞、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；pMD-19T载体(批号：6013)、T4 DNA Ligase(批号：2011A)、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒(批号：RR047Q)购自宝生物工程(大连)有限公司；Lipofectamine 2000(批号：12566014)、胎牛血清(批号：16010159)、DMEM/F12培养基(批号：11320033)、ECL发光液(批号： 34580)购自赛默飞世尔科技公司；CCK-8试剂盒(批号：C0037)、Edu染色试剂盒(批号：C0071S)、BCA蛋白定量试剂盒(批号：P0010)购自碧云天生物技术公司；p27抗体(批号：25614-1-AP)购自武汉三鹰生物技术有限公司；CDK2抗体(批号：35361)购自Signalway Antibody公司；CDK5抗体(批号：D120397)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；β-Actin抗体(批号：CW0096)、HRP标记山羊抗兔二抗(批号：CW0103S)、HRP标记山羊抗鼠二抗(批号：CW0102S)购自北京康为世纪生物科技有限公司；RIPA裂解液(批号：AR0102)购自武汉博士德生物公司； PVDF膜(批号： IPVH00010)购自美国Millipore公司；SDS-PAGE凝胶试剂盒(批号：JCPE022)购自西安晶彩生物公司。

1.3 总RNA提取与反转录

取奶山羊乳腺组织，用TRIzol试剂提取总RNA。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA，置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.4 p27基因克隆

1.4.1 引物设计与合成

根据山羊的p27基因序列(GenBank登录号：XM_005680816.3)，利用Primer 5.0软件设计引物，上、下游引物分别带有BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物信息如表1所示。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

1.4.2 基因克隆及表达载体构建

p27基因PCR扩增反应体系共25 μL，包括 cDNA 模板1.0 μL，上、下游引物(10 mmol/L)各0.5 μL，LA Taq聚合酶0.25 μL，dNTP 2.0 μL，10×LA Taq Buffer 2.5 μL，超纯水18.25 μL。PCR扩增程序为：95 ℃ 预变性3 min；95 ℃ 变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环；72 ℃再延伸10 min；4 ℃保存。采用1.0%琼脂糖凝胶电泳对PCR反应产物进行检测，切胶回收并连接pMD-19T载体，使用热激法将连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，涂板并挑取单菌落进行LB液体培养。培养16 h后，菌液PCR筛选阳性克隆，并对阳性克隆进行测序验证。利用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ限制性内切酶对目的片段和pcDNA3.1(+)载体分别进行双酶切，然后将目的基因与克隆载体连接转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。后续进行单克隆培养、质粒提取及酶切鉴定，质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司做进一步测序鉴定。测序正确的质粒即为山羊p27基因真核表达质粒pcDNA 3.1-p27。

1.5 生物信息学分析

利用DNAMAN软件进行氨基酸同源性分析；利用TMHMM在线软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)预测跨膜结构域；利用Expasy(https://web.expasy.org)线上分析蛋白的理化性质；利用SignalP 5.0预测蛋白信号肽；利用SOPMA、SWISS-MODEL软件预测蛋白二级、三级结构；利用STING交互式数据库(http://www.string-db.org)进行蛋白互作分析。

1.6 细胞培养与转染

培养基配制如下：5 mg/mL胰岛素400 μL、5 μg/mL氢化可的松200 μL、100 U/mL青霉素/链霉素200 μL、10 ng/mL表皮生长因子20 μL、10%胎牛血清20 mL，DMEM/F12补充体系至200 mL。将奶山羊原代乳腺上皮细胞接种于6孔板中，每孔约接种2×105个细胞。待细胞融合度达到70%时，分别转染pcDNA3.1空载体及pcDNA3.1-p27，转染时间为48 h。参照Lipofectamine 2000说明书配置siRNA转染复合物，2 μL转染试剂Lipofectamine 2000中加入1 μg 质粒。基因沉默采用siRNA技术，siRNA序列信息如表2所示。实验分为siRNA-NC组(转染50 nmol/L无干扰作用的siRNA-p27阴性对照siRNA)和siRNA-p27组(转染50 nmol/L具有干扰作用的siRNA-p27)，转染方法同上。利用qPCR及Western blot检测细胞中p27基因的表达情况，验证转染效果，用于后续实验。

表2 siRNA序列信息Tab.2 Sequence information of siRNA

1.7 CCK-8和Edu分析

通过CCK-8和Edu分析，明确p27基因对奶山羊原代乳腺上皮细胞增殖的影响。当细胞生长汇合至70%时，将pcDNA3.1-control和pcDNA3.1-p27转染细胞。转染48 h后进行CCK-8分析，按照试剂盒操作说明进行操作，96孔板每孔加入10 μL CCK-8试剂，置于37 ℃培养箱中孵育1 h，用酶标仪检测OD450 nm值。转染48 h后进行Edu分析，按照试剂盒操作说明进行操作，24孔板每孔用300 μL终浓度25 μmol/L的Edu溶液孵育细胞4 h，染色后使用荧光倒置显微镜拍照。上述实验均设置6个重复。

1.8 实时荧光定量PCR检测

采用TB Green Ⅱ试剂盒进行实时荧光定量PCR(qPCR)。反应体系为15 μL，包括SYBR®Premix Ex TaqTM(2×) 7.5 μL，模板cDNA 1 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.7 μL，ddH2O 5.1 μL。PCR反应条件为：95 ℃保持3 min；95 ℃保持10 s，55 ℃保持30 s，共40个循环。采用UXT为内参基因。每个样品设置3个重复，结果以平均值±标准差的形式表示。利用SPSS统计软件对数据进行显著性分析，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

1.9 Western blot检测

收集对数期细胞5×106个，加入200 μL RIPA裂解液提取细胞总蛋白，利用BCA蛋白法测定蛋白浓度。取25 μg蛋白进行SDS-PAGE，90 V条件下电泳1 h。将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h；洗涤后加入一抗，4 ℃ 孵育过夜；次日TBST清洗，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h；加入适量ECL超敏发光液，利用天能Tanon 3500全自动数码凝胶成像分析系统显影，使用Image J软件计算目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 p27基因克隆

以西农萨能奶山羊乳腺组织cDNA为模板，克隆得到p27基因CDS序列，全长597 bp(图1)。测序后进行NCBI BLAST比对，确定为山羊p27基因。

M为DNA marker。

2.2 生物信息学分析

从NCBI数据库下载其他物种的p27蛋白序列，利用DNAMAN软件对所得序列进行氨基酸序列比对(图2)。结果显示山羊p27蛋白与绵羊(XP_004006899.2)、牛(NP_001093816.1)、猪(NP_999481.1)、人(NP004055.1)、马(XP_023498912.1)、狗(NP_001002957.2)、小鼠(NP_034005.2)p27蛋白的编码氨基酸同源性分别为97%、95%、94%、91%、90%、90%和85%。利用Expasy进行p27蛋白理化性质分析，结果表明山羊p27蛋白分子质量约为22.1 ku，体外和体内半衰期分别为30 h和10 h；不稳定系数显示p27蛋白为不稳定蛋白，且属于亲水蛋白。

图2 不同物种p27蛋白序列比对Fig.2 Alignment of p27 protein sequences among different species

通过在线SMART和ScanProsite软件预测p27蛋白的无信号肽和跨膜结构，结果如图3a、3b所示。SOPMA在线分析结果显示，西农萨能奶山羊p27蛋白的二级结构中α-螺旋、β-折叠、延伸链和无规则卷曲比例分别为16.16%、1.01%、10.10%、72.73%(图3c)。通过SWISS-MODEL程序预测p27蛋白的三级结构，结果如图3d所示。STRING在线预测发现，山羊p27蛋白与CDK2、CDK4、CDK6、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CCNE2、CCNA1、CCNA2等蛋白存在互作关系(图3e)。

CDK2为周期蛋白依赖性激酶2；CDK4为周期蛋白依赖性激酶4；CDK6为周期蛋白依赖性激酶6；CCND1为细胞周期蛋白D1；CCND2为细胞周期蛋白D2；CCND3为细胞周期蛋白D3；CCNE1为细胞周期蛋白E1；CCNE2为细胞周期蛋白E2；CCNA1为细胞周期蛋白A1；CCNA2为细胞周期蛋白A2。

2.3 不同时期乳腺中p27基因的表达分析

实时荧光定量PCR结果显示(图4)，西农萨能奶山羊p27基因在泌乳前期和泌乳后期表达量较高，但各个时期的表达量差异不显著，推测p27基因在整个泌乳过程中均发挥重要作用。

图4 不同时期乳腺组织中p27基因的表达情况Fig.4 Expression of p27 gene in mammary tissue at different stages注：n.s.代表组间差异不显著。

2.4 p27基因抑制奶山羊原代乳腺上皮细胞增殖

分别将pcDNA3.1-p27和pcDNA3.1-control转染奶山羊原代乳腺上皮细胞，以评价p27基因对奶山羊原代乳腺上皮细胞增殖的影响。qPCR结果显示(图 5a)，pcDNA3.1-p27转染细胞内p27基因的mRNA表达水平升高(P<0.01)。CCK-8分析结果显示(图5b)， pcDNA3.1-p27转染细胞内24 h的细胞活力降低(P<0.01)。Edu染色结果显示(图6)， pcDNA3.1-p27转染细胞内阳性细胞比例下降(P<0.01)。与对照组相比，pcDNA3.1-p27转染细胞内CDK2、Bcl-xl、Bad、Bax基因的mRNA表达水平无显著变化 (图7)。以上结果证实，p27基因可以抑制奶山羊原代乳腺上皮细胞增殖。

图5 p27基因影响乳腺上皮细胞增殖的qPCR和CCK-8测定结果 Fig.5 qPCR and CCK-8 results for the effect of p27 gene on the proliferation of mammary epithelial cells注：**表示组间差异极显著。

图6 p27基因影响乳腺上皮细胞增殖的Edu染色结果Fig.6 Edu staining results for the effect of p27 gene on the proliferation of mammary epithelial cells注：网络版为彩图。

图7 p27基因对细胞增殖基因mRNA表达的影响Fig.7 Effects of p27 gene on mRNA expression of cell proliferation genes

2.5 p27基因对细胞周期蛋白激酶相关蛋白的影响

Western blot测定结果显示，与对照组相比，pcDNA3.1-p27转染细胞内p27和CDK2蛋白的表达量极显著升高(P<0.01，图8)。与siRNA-NC组相比，siRNA-p27组细胞内p27和CDK2蛋白的表达量极显著降低(P<0.01，图9)。以上结果表明，过表达p27基因可以促进细胞中CDK2蛋白的表达，而干扰p27基因可以抑制细胞中CDK2蛋白的表达。

图8 过表达p27基因对细胞周期蛋白依赖性激酶相关蛋白的影响Fig.8 Effects of p27 overexpression on the cyclin dependent kinase-related proteins注：**表示组间差异极显著。

3 讨论

p27蛋白作为一种公认的细胞周期调控因子，可与CDK亚单位结合，在细胞增殖、分化和凋亡过程中发挥关键作用[13-14]。有研究表明，p27-/-小鼠表现出乳腺脂肪垫发育不全、导管分支减少、无法正常分泌乳汁的症状[15]。正常情况下，G0期p27定位于细胞核内并阻滞CDK2活性，G1期p27迁移至细胞质，细胞进入S期后cyclin E蛋白水平上升，从而导致p27磷酸化水平升高。当p27蛋白被磷酸化后，细胞质中的p27蛋白通过泛素-蛋白水解途径水解失活[16]。本研究中克隆得到的奶山羊p27基因序列全长597 bp，编码198个氨基酸。生物信息学分析表明， p27蛋白在体内半衰期较短，稳定性差；其在不同物种中的氨基酸同源性较高，具有一定的保守性；此外，p27蛋白不存在跨膜区域，二级结构、三级结构预测结果中无规则卷曲含量较高。有研究表明，p27属于无结构蛋白家族的成员之一，缺乏稳定的二级、三级结构，只有遇到与其相互作用的因子时才发生折叠[17]。上述报道与本研究的预测结果一致，提示 p27可能在乳腺上皮细胞中具有重要作用，且稳定性较低。因此，探究p27在乳腺上皮细胞中的功能尤为重要。

图9 沉默p27基因对细胞周期蛋白依赖性激酶相关蛋白的影响Fig.9 Effects of p27 interference on the cyclin dependent kinase-related proteins注：**表示组间差异极显著。

乳腺发育开始于胚胎阶段，其在卵巢、胎盘、垂体激素的刺激下加速导管生长和分支。在妊娠期，乳腺导管上皮细胞会经历快速增殖和分化，导致泌乳发生[10]。尽管乳腺发育过程中的细胞增殖受到严格调控，但对细胞周期在该过程中的作用不甚了解。乳腺上皮细胞的数量和每个细胞的泌乳能力是整个泌乳过程周期性变化及产奶量的主要影响因素。有丝分裂信号可以通过激活细胞周期蛋白-细胞周期蛋白依赖性激酶复合物刺激细胞分裂[14]。 研究发现，细胞周期蛋白cyclin D1对泌乳具有重要调控作用[18]。p27可以抑制cyclin-CDKs复合物的活性而对细胞周期进行负调控。本研究发现，p27基因在奶山羊泌乳期的表达量高于干奶期，表明p27基因可能是调控乳腺上皮细胞增殖和乳腺发育的关键基因。本研究的CCK-8检测结果表明,过表达p27基因可以抑制奶山羊乳腺上皮细胞增殖；同时，Edu检测结果表明,过表达p27基因可以抑制DNA合成。根据以上结果，推测p27基因能够通过调控细胞周期以及DNA合成进一步影响乳腺上皮细胞的增殖活性。蛋白互作分析发现，p27蛋白与CDK2、CDK4、CCND1、CCNE2、CDK6、CCNE1、CCNA2、CCNA1等蛋白存在互作关系，揭示p27可能通过与周期蛋白的相互作用，调节乳腺上皮细胞增殖。本研究还发现过表达和沉默p27基因会影响CDK2蛋白的表达，表明二者之间具有一定的相互作用，然而这一过程有关的分子机制有待深入研究。

4 结论

本研究成功克隆出西农萨能奶山羊p27基因CDS序列，序列全长597 bp，共编码198个氨基酸;编码蛋白无跨膜结构，属不稳定亲水蛋白。qPCR结果表明p27基因在乳腺组织中表达水平相对稳定，泌乳期表达量高于干奶期。过表达p27基因可以显著降低乳腺上皮细胞增殖和DNA合成，且在该过程中 CDK2蛋白的表达水平升高，提示p27蛋白与CDK2蛋白存在互作关系。本研究结果证实，p27可作为负调节因子参与乳腺上皮细胞增殖，为p27调控乳腺发育的分子机理提供了基础资料。