4个糖酵解途径基因的siRNA干扰及其在肌肉卫星细胞中的沉默效应

刘永峰，李 衡，付尚辰，肖 宇

(陕西师范大学 食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710119)

动物宰后肌肉在一定时间内仍具有生命活动，在经历一系列生化变化后形成可食用的肉[1]。由于宰后肌肉细胞很快进入缺氧状态，糖酵解成为畜禽宰后肉品质成熟过程中肌肉能量代谢的主要类型，对肉品质形成起到重要作用[2-4]。

糖酵解途径作为宰后重要代谢途径，其影响因素很多，其中蛋白磷酸化修饰可通过调节糖酵解过程中的酶活性而影响糖酵解速率。已有研究主要涉及储存时间、温度等外界条件变化对宰后肌肉中蛋白磷酸化的影响。张艳等研究了冰温贮藏过程中羊肉蛋白磷酸化水平的变化[5]；任驰通过对宰后羊肉不同储存条件的研究，发现糖酵解相关酶和肌肉收缩相关蛋白是2大类主要的磷酸化蛋白质[6]；刘满顺通过蛋白组学研究发现，与糖酵解途径密切相关的磷酸果糖激酶(phosphofructokinase，PFKM)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PKM)和果糖二磷酸醛缩酶A(fructose-bisphosphate aldolase A，ALDOA)的磷酸化水平在高品质和低品质羊肉中存在极显著差异[7]。PFKM、PKM、PGK1和ALDOA都是糖酵解途径中的重要酶，其中，PFKM可催化果糖-6-磷酸生成果糖-1，6-二磷酸这一不可逆反应，是糖酵解途径的关键调节酶和葡萄糖代谢途径的限速酶[8-9]；PKM催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成丙酮酸和ATP；PGK1催化1,3-二磷酸甘油酸生成3-磷酸甘油酸；ALDOA催化糖酵解途径中果糖1,6-二磷酸、磷酸二羟丙酮、甘油醛-3-磷酸之间的转变。蛋白磷酸化修饰属于蛋白质在翻译后水平上的调控，而细胞内部对这些酶编码基因的表达调控(转录水平)及相关机制尚不明确。

近年来对肉品质相关功能基因的研究很多，但已报道的相关研究多针对某个或少数肉品质相关基因。参与脂肪酸摄取和转运的脂肪酸结合蛋白(fatty acid-binding proteins, FABPs)I-FABP、L-FABP、H-FABP等在脂质代谢调节中发挥作用[10]。钙蛋白酶(calpain，CAPN)是一类需要钙离子调节的内源性蛋白水解酶，参与机体信号转导、肌纤维生长发育及降解等过程，在宰后肉嫩化过程中发挥重要作用，与肉的嫩度、色泽等品质形成密切相关[11-14]。阿黑皮素原(pro-opiomelanocortin,POMC)是能量平衡调控中发挥重要作用的一种大分子蛋白激素前体物[15]。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-actived receptor,PPAR)PPARA、PPARG是影响甘油三酯合成和脂肪酸沉积、在脂肪组织中调控脂肪酸代谢的核心转录因子[16]。二酰基甘油酰基转移酶1(diacylglycerol-O-acyltransferase1, DGAT1)在能量调节和葡萄糖代谢中发挥重要作用，与脂肪吸收及储存过程中甘油三酯的合成和代谢密切相关，能够促进肌内脂肪沉积进而改变肉品质[17]。肉品质性状受到机体内、外诸多因素的影响，在体内是许多基因参与表达调控的复杂过程，而宰后成熟过程是肉品质性状形成的重要阶段。糖酵解途径作为宰后重要的代谢途径，对肉品质形成非常关键，解析糖酵解关键基因与上述肉品质相关功能基因在转录水平上的相互作用，有助于深入了解肉品质形成过程中的内部调控机制。

小分子干扰RNA(siRNA)通过将双链RNA导入细胞特异性降解mRNA，减弱或抑制目的基因的表达[18]，该技术在基因功能研究中应用广泛。细胞转染是将外源基因导入细胞的分子生物学技术，主要有电穿孔、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀和脂质体转染等方法[19]。其中，脂质体转染法是一种以脂质双分子层作为载体，包裹外源基因，并通过融合方式导入细胞的方法，因具有操作简便、细胞毒性低、对细胞损伤小等优点而常被使用。

基于此，本研究以山羊腿部肌肉为原材料分离纯化卫星细胞，利用siRNA干扰糖酵解途径关键基因PKM、PFKM、PGK1、ALDOA在肌肉卫星细胞中的表达，并进一步探究上述基因与其他15个肉品质相关功能基因之间的表达调控互作机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

细胞实验材料取自冻存于-80 ℃冰箱的新生山羊腿部肌肉组织；LipofectaminTM 3000转染试剂购于Invitrogen公司；siRNA由上海吉玛基因公司设计并合成；Opti-MEM减血清培养基、DMEM/F-12基础培养基、胎牛血清(FBS)和马血清(HS)购于Gibco公司；RNA提取试剂(Trizol)、反转录试剂(Prime Script RT Reagent Kit)和定量试剂(SYBR Green Real-Time PCR Master Mix)购于Takara公司；中性蛋白酶、胶原蛋白酶Ⅱ、HBSS缓冲液和HEPES缓冲液购于Sigma公司；双抗购于Hyclone公司；MgCl2、PBS缓冲液、氯仿和异丙醇均为分析纯，购于福晨(天津)化学试剂有限公司。

中性蛋白酶溶液：0.056 g中性蛋白酶溶于10 mL HEPES缓冲液(20 mmol/L)；胶原蛋白酶Ⅱ溶液：0.04 g胶原蛋白酶Ⅱ溶于10 mL HBSS(1×)缓冲液；双酶酶解液：中性蛋白酶和胶原蛋白酶Ⅱ的混合液；HEPES缓冲液(20 mmol/L)：0.2 mL的HEPES(1 mol/L)中加入10 mL ddH2O混合均匀；MgCl2储存液(1 mol/L)：2.033 g MgCl2·6H2O中加入10 mL ddH2O充分溶解；MgCl2工作液(5 mmol/L)：100 μL MgCl2储存液(1 mol/L)中加入上述双酶酶解液；PBS冲洗缓冲液：PBS缓冲液中加入8%双抗；完全培养基：由DMEM/F-12基础培养基、20% FBS和1%双抗组成；分化培养基：由DMEM/F-12基础培养基、2% HS和1%双抗组成。

1.2 仪器与设备

二氧化碳细胞培养箱，新加坡ESCO公司；IX71荧光倒置显微镜，日本Olympus公司；微量紫外分光光度计，上海美析仪器有限公司；反转录仪，美国Bio-Rad公司；实时荧光定量PCR仪，美国Bio-Rad公司；电泳仪，北京六一仪器厂；凝胶成像系统，美国梅洁公司；SW-CJ-1FD超净工作台，苏州净化设备有限公司；低温冷冻离心机，德国Eppendorf公司。

1.3 实验方法

1.3.1 siRNA的设计与合成

在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中查询山羊PKM、PFKM、PGK1、ALDOA基因的mRNA序列，根据CDS序列设计目的基因的siRNA序列和阴性对照(negative control, NC)序列，如表1所示。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.3.2 山羊肌肉卫星细胞的分离与培养

取新生山羊腿部肌肉组织2 g，充分剪碎后用PBS缓冲液冲洗，然后使用双酶酶解液在37 ℃摇床上消化30 min，4 ℃、50 g条件下低速离心，100 μm过滤器过滤消化液。取滤液在4 ℃、300 g条件下离心，收集底层细胞重悬于生长培养基中，置于37 ℃、体积分数为5% CO2的培养箱中培养。山羊肌肉细胞采用完全培养基进行传代培养至第2代，传至2代再次传代后接种于6孔板中。将培养皿放置于37 ℃、体积分数为5% CO2的培养箱中，每隔24 h在显微镜下观察细胞的生长状态，细胞体积分数达到约80%时进行转染。

1.3.3 细胞转染与诱导分化

细胞培养至对数生长期时更换为Opti-MEM培养基，将细胞分为si-PKM、si-PFKM、si-PGK1、si-ALDOA4个siRNA转染组，每个转染组同时设置1个平行阴性对照组(NC)，即NC1、NC2、NC3、NC4。每个转染组及其对照组各设置3个复孔。按LipofectamineTM 3000转染试剂盒说明书分别配置转染试剂，将配置好的转染试剂混合后孵育15 min，然后在每孔细胞培养液中各加入200 μL，轻摇混匀后置于培养箱中。转染5 h后，将培养基更换为2% HS低血清含量的分化培养基进行诱导分化培养，并分别于诱导分化0、2、3、4、5 d后，采用400×倒置显微镜观察肌肉卫星细胞的生长情况。

1.3.4 细胞总RNA提取及cDNA合成

将诱导分化5 d的肌肉卫星细胞培养液弃去，PBS缓冲液冲洗2～3遍。每孔加入1 mL Trizol裂解液，参照陈雪梅等[20]的方法，分别提取4个siRNA转染组及相应NC组的总RNA。测定RNA的浓度和纯度，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。利用反转录试剂盒进行逆转录，用于后续qPCR实验。

1.3.5 目的基因与监测基因的表达量测定

引物合成：筛选15个肉品质相关功能基因作为监测基因，从NCBI数据库中查找4个目的基因和15个监测基因的CDS序列，采用Primer 3.0分别设计qPCR引物，并在Primer-BLAST上检测引物特异性。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，引物序列如表2所示。

表2 目的基因和监测基因的qPCR引物序列Tab.2 The qPCR primer sequences of target genes and monitoring genes

相对表达量测定：以山羊GAPDH为内参基因(124 bp)，其上游引物为5′-AGTTCAACGGCACAGTCAAGG-3′，下游引物为5′-ACCACATACTCAGCACCAGCA-3′。采用SYBR Green Ⅰ染料法进行目的基因和监测基因的qPCR测定，反应体系10 μL，包含2×Ultra SYBR Mixture 5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.3 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 3.4 μL。扩增反应程序为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环；72 ℃总延伸3 min。每个样品设置3个重复，根据实时荧光定量反应得到的Ct值，采用2-ΔΔCt法计算4个目的基因和15个监测基因的相对表达量。

1.4 数据处理

利用Excel 2010对实验数据进行初步统计，采用SPSS 24.0软件对实验数据做进一步分析，组间比较采用独立样本T检验法。

2 结果与分析

2.1 细胞分离培养及转染后的诱导分化结果

经过6 h培养后,分离、纯化得到的山羊肌肉卫星细胞如图1所示。可以看出，细胞呈短梭形或多角形，已经开始贴壁的细胞延伸呈典型的细长梭形，折光性较强。上述结果证实，通过分离、培养得到了山羊原代肌肉卫星细胞。

图1 山羊肌肉卫星细胞Fig.1 Goat muscle satellite cells注：网络版为彩图。

诱导分化培养0、2、3、4、5 d的4个转染组和4个NC组细胞表型如图2所示。结果显示，诱导分化培养0 d时，转染组和NC组的山羊肌肉卫星细胞形状均较圆润，呈多角形或短梭形，在培养基中分散分布；相较于NC组，转染组细胞的细胞质明显浓厚且折光性更强。从诱导分化培养2 d开始，转染组和NC组的细胞数目均增多，排列也更为密集，大部分细胞开始逐渐恢复贴壁细胞形态，细胞延长呈细长梭形或纺锤形，四周逐渐伸出凸起，呈星形；转染组与NC组细胞之间无明显差异。诱导分化培养3～5 d时，转染组和NC组的细胞数目继续增多，呈一定规律紧密平行排列，少数细胞逐渐由单核进入合体细胞阶段，有长竹状肌管(亮斑处为肌管)形成，肌管数量有增多趋势。

NC1、NC2、NC3、NC4分别代表si-PKM、si-PFKM、si-PGK1、si-ALDOA转染组的阴性对照组。

综上，转染组和NC组细胞均能进行正常生长分化，呈现出山羊肌肉卫星细胞特有的增殖分化特点。除诱导分化培养0 d时转染组比NC组细胞质浓厚且折光性强外，之后转染组细胞的表型和生长特点与NC组之间无明显差异。转染组在诱导分化0 d时细胞质浓厚、折光性强，可能是由于转染试剂LipofectamineTM 3000具有一定毒性，但随着诱导分化时间的延长，RNA干扰没有对细胞表型及正常增殖造成影响，可以进行下一步的细胞沉默效应检测及定量表达分析。

2.2 RNA提取与鉴定

采用琼脂糖凝胶电泳对提取的RNA质量进行检测，结果如图3所示，每组RNA的3条带无降解。同时，利用核酸分析仪测定RNA的浓度和纯度，发现吸光度A260/A280比值均在1.7～2.0之间。以上结果说明提取的RNA质量良好，可以用于下一步实验。

M代表DNA Marker 2 000；1—8分别代表诱导分化培养5 d时4个NC组(NC1、NC2、NC3、NC4)和4个转染组(si-PKM、si-PFKM、si-PGK1、si-ALDOA)的细胞RNA。

2.3 目的基因的mRNA表达

siRNA转染组及NC组中目的基因的mRNA相对表达情况如图4所示。干扰处理后，4个目的基因的mRNA表达水平均呈现下调趋势，转染组中PKM、PFKM、PGK1、ALDOA的相对表达量分别比NC组降低33.50%±0.94%、93.80%±0.49%、91.03%±7.80%、66.12%±4.02%。转染组中PKM、PFKM、ALDOA的mRNA表达水平均与对应NC组间差异极显著(P<0.01)，PGK1的mRNA表达水平与对应NC组间差异显著(P<0.05)。PFKM和PGK1的相对表达量降低较多，说明二者沉默效果较好。

2.4 糖酵解基因干扰对肉品质功能基因表达的影响

15个肉品质功能基因的mRNA相对表达情况如图5所示。在si-PKM转染组中，随着PKM表达量的降低，MYPN、ACOX1、MSTN、PPARA、PPARG、NR1H3、PNPLA、LDHA、H-FABP和CAPN1基因的表达水平下调，且除MYPN和NR1H3下调水平不显著外，其余基因与NC组间的表达差异均达到显著水平或极显著水平；上调基因中，POMC基因的表达水平显著高于NC组，L-FABP、I-FABP、CAPN3和DGAT1基因的表达水平极显著高于NC组。在si-PFKM转染组中，随着PFKM表达量的下降，MYPN、ACOX1、MSTN、PPARA、PPARG、NR1H3、PNPLA、LDHA、L-FABP、H-FABP、CAPN1和CAPN3等12个基因的表达水平下调，且均显著或极显著低于NC组；而POMC和I-FABP基因的相对表达量分别显著和极显著高于NC组。在si-PGK1转染组中，随着PGK1表达量的下降，MYPN、ACOX1、MSTN、PPARA、PPARG、NR1H3、PNPLA、LDHA、L-FABP、H-FABP、CAPN1和CAPN3基因的表达下调，除H-FABP表达量显著低于NC组外，其他基因的表达量均极显著低于NC组；而POMC、I-FABP和DGAT1基因的相对表达量上调，且均极显著高于NC组。在si-ALDOA转染组中，随着ALDOA表达量的下调，MYPN、ACOX1、POMC、PNPLA、LDHA、H-FABP、CAPN1和DGAT1基因的表达量显著或极显著低于NC组；I-FABP基因的表达量极显著高于NC组。

综上，在4个目的基因的干扰下，LDHA、MYPN、ACOX1、PNPLA和CAPN1基因的相对表达水平均下降，除si-PKM转染组中的MYPN基因外，上述转染组基因的表达水平均与NC组间差异显著或极显著。DGAT1和POMC基因的表达水平在 si-PKM、si-PFKM和si-PGK1转染组中上调。值得注意的是，I-FABP基因的相对表达量在4个转染组中均极显著高于NC组，说明4个糖酵解途径目的基因的干扰对I-FABP基因的表达都产生了重要影响。

3 讨论

肌肉卫星细胞具有成肌和成脂分化能力，是研究肉品质形成机制的良好模型[21]。本研究采用双酶酶解法分离纯化得到山羊肌肉细胞，并通过培养成功得到能够稳定增殖分化的原代山羊肌肉卫星细胞，所得山羊肌肉卫星细胞的表型特征与乌日罕和吴海青研究中的羊肌肉卫星细胞表型一致[22-23]。对4个糖酵解途径关键基因干扰后，通过表型观察发现转染组与对照组细胞仅在转染开始时存在一定差异，这可能是由转染试剂的毒性造成的[24]；随着培养时间的增加，转染组与对照组细胞在增殖特点和表型上没有明显差异。

细胞转染是研究细胞内部基因表达调控机制的重要手段，但原代细胞转染较为困难，且不同转染组间的沉默效率也存在一定差异。本研究通过实时荧光定量PCR检测发现，4个干扰目的基因(PKM、PFKM、PGK1和ALDOA)的表达抑制程度具有差异，4个目的基因的表达量降低33.5%～93.8%。同时，在4个转染组中，相同肉品质监测基因的mRNA表达量有一定差异，这可能也与4个目的基因的表达抑制程度不同有关。

4个糖酵解途径目的基因受到抑制后，肉品质相关基因LDHA、MYPN、ACOX1、PNPLA和CAPN1的相对表达量均下降。其中，LDHA可催化丙酮酸与乳酸之间的转变[25]，其表达下调可能是糖酵解关键酶基因的表达下调使糖酵解速率降低，协同抑制了LDHA基因的表达；MYPN、ACOX1、PNPLA和CAPN1分别在肌肉组织结构组装、脂肪酸β氧化调节、糖脂代谢调控(脂肪积累和动员)、肌肉纤维生长和水解等过程中发挥作用[11, 26-27]，这些基因表达下调说明目的基因干扰对脂肪酸氧化、糖脂代谢及肌肉结构组装生长等通路具有重要影响。转染组中POMC、I-FABP和DGAT1基因的表达水平呈现明显上调趋势，其中I-FABP基因的相对表达量在4个转染组中均极显著高于对照组，说明干扰糖酵解途径基因对I-FABP基因具有重要调节作用。POMC参与细胞能量和脂质代谢途径的调节[15]，DGAT1在促进细胞脂肪酸吸收和转化中发挥作用[17]，I-FABP在脂肪酸摄取、转运及代谢调节中具有重要作用[10]。三者表达量上调说明在糖酵解目的基因的干扰作用下，细胞内调动了能量和脂质代谢相关途径基因的表达，推测目的基因干扰降低了糖酵解速率，细胞为平衡糖酵解途径能量变化，增加了能量代谢和脂质代谢相关基因的表达。

在糖酵解途径相关酶的研究中，林珩迅等从代谢角度阐述了冰温贮藏对猪肉品质劣变的影响，发现冰温贮藏可以通过降低糖酵解过程中的关键酶(如已糖激酶、磷酸果糖激酶等)活性来减缓糖酵解速率[28]。而本研究是在体外培养的肌肉细胞中采用RNA干扰的方式抑制糖酵解途径关键基因的表达，这与低温贮藏相似，均在一定程度上降低了糖酵解途径速率。但本研究主要在基因转录水平上探究干扰糖酵解途径对肉品质相关基因表达调控的分子机制，证实干扰糖酵解途径关键酶基因表达主要影响到细胞能量代谢、糖脂代谢以及细胞组织结构形成通路，其中脂质代谢和能量调节通路基因在目的基因干扰下受到的影响最大。

4 结论

本研究以山羊肌肉卫星细胞为材料，利用RNA干扰技术抑制糖酵解代谢途径中关键基因PKM、PFKM、PGK1和ALDOA的表达，以探究干扰基因与肉品质形成相关基因的互作关系。RNA干扰后，山羊肌肉卫星细胞均可进行正常增殖分化，4个糖酵解途径目的基因的表达水平下调33.5%～93.8%，同时肉品质监测基因的表达水平也受到目的基因的影响。目的基因干扰后，对细胞能量代谢、糖脂代谢和细胞组织结构形成通路相关基因的表达影响较为明显，其中对脂肪酸摄取、转运及代谢调节基因I-FABP的影响最为显著。研究结果为在基因水平上进一步探究肉品质形成的内在调控机制提供了参考。