基于深共晶溶剂溶解的虾青素及其乳液包埋体系制备与调控

方溶熙，周 鹏，谢云霄，雷 婵，吴逸岚，李 斌，刘石林

(华中农业大学 食品科学技术学院，湖北 武汉 430070)

虾青素(astaxanthin, AXT)是一种萜烯类不饱和化合物，其分子结构中具有共轭双键且两端均是以异戊二烯为单元的六元环，因此具有较强的电子效应，能够有效清除自由基、单线态氧和羟基自由基[1]。此外，AXT还可以改善皮肤状况[2]、保护眼睛[3]、维护心血管系统和神经系统功能[4-5]、调节免疫反应[6]。作为一种功能活性因子，AXT在食品、药品、化妆品等行业中具有巨大应用潜力[7]，被广泛应用于软凝胶、微胶囊、奶油、能量饮料等领域[8]。然而，AXT分子极性较低，水溶性差，限制了其在水介质食品中的应用；AXT的化学性质也不稳定，在加工和贮藏过程中极易发生氧化降解而丧失生物活性，生物可及性较低[9]。上述问题已经成为当前制约AXT行业发展的关键因素之一。

乳化包埋法是当前保护亲脂性营养素的常见方法，能够实现对AXT的有效保护[10]。乳化包埋法通常先将脂溶性成分溶于油相中，再在一定的外力作用下将油相体系均匀分散于含有乳化剂的水相体系中以形成乳液，油滴周围由乳化剂分子组成一层界面层。Boonlao等将AXT油树脂溶于鱼肝油中，通过乳化包埋法制备得到AXT乳液，该乳液在低温下具有较好的储藏稳定性，但AXT油树脂在鱼肝油中的溶解度仅为1%左右，AXT包埋量较低[11]。Dai等将AXT溶于二氯甲烷中，通过乳化-溶剂挥发法制备得到AXT微粒，并通过喷雾干燥得到AXT微胶囊；所得AXT微胶囊表面光滑，表面油含量低，流动性好；但此方法采用二氯甲烷溶解AXT，存在一定的安全与健康隐患，且AXT的溶解度也仅为1%左右，包埋量较低[12]。考虑到AXT在氯仿、丙酮等有机溶剂中的溶解量有限且存在安全隐患，探索可以安全、健康地溶解AXT并提高其溶解度的有效乳液包埋体系是成功制备AXT乳液的关键。

深共晶溶剂(deep eutectic solvent，DES)是由2种或2种以上组分以特定摩尔比例混合并通过氢键相互作用而形成的共熔物，其中1种组分是氢键受体(hydrogen bond acceptor，HBA)，另1种组分是氢键供体(hydrogen bond donor，HBD)[13]。DES的熔点低于其所含任何单一组分的熔点，具有化学性质稳定、组分简单、低毒、价格低廉、生物可降解、环境友好等优点，溶解能力强，AXT溶解量高[14]。

基于此，本研究以麝草香酚和月桂酸组成的疏水性DES为油相溶剂，将AXT溶解于DES中形成AXT-DES油相，以明胶和阿拉伯胶为水相乳化剂，通过高速剪切制备得到AXT乳液。在此基础上，进一步研究所得AXT乳液的形貌、稳定性、流变学特性、生物可及性和抗环境因素影响能力，探索安全、健康、高效的AXT乳液包埋体系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

AXT购自新和成有限公司；明胶(B型，240 g Bloom)和月桂酸(分析纯，98%)购自阿拉丁试剂有限公司；麝草香酚(分析纯，98%)购自Macklin生化有限公司；其他分析级试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

MICCRA-D9型剪切机，德国Miccra有限公司；EX31型显微镜，舜宇集团仪器有限公司；KQ-300DB型水浴超声清洗器，昆山超声波仪器有限公司；Discovery DHR-2型流变仪，美国TA仪器有限公司；TURBISCAN TOWER型多重光散射分析仪，法国Formulaction有限公司。

1.3 AXT乳液制备

将麝草香酚和月桂酸以3∶1的摩尔比混合，70 ℃水浴锅中磁力搅拌至澄清透明，静置冷却至室温，制得DES。将AXT加入DES中(AXT质量分数为5%)，80 ℃条件下磁力搅拌5.3 h至AXT溶解，以此作为油相。乳液的水相为明胶和阿拉伯胶的混合溶液。取不同明胶/阿拉伯胶质量比(1、2.5、5、10)和不同乳化剂(明胶+阿拉伯胶)质量分数(1%、1.5%、2%、3%)的水相，逐滴加入油相，以11 000 r/min的转速在剪切机中高速剪切乳化。保持水相与油相的质量比为9∶1。

1.4 微观形貌观察

取1滴乳液于光滑干净的载玻片上，盖上盖玻片不留气泡，置于载物台上，40倍镜头下观察乳液的微观形貌。乳液粒径通过Image J计数软件获得，随机选择光学显微照片的计数区域，所计液滴个数不少于300个。

1.5 稳定性测定

利用多重光散射分析仪测定不同乳化剂含量的乳液稳定性。取20 mL乳液置于圆柱形玻璃管中，25 ℃条件下测量12 h，每隔10 min扫描1次样品。通过稳定性指数(T)的变化评估乳液稳定性，计算公式如下：

(1)

1.6 流变学性质测定

利用配备60 mm铝锥板的旋转式流变仪测试不同明胶/阿拉伯胶质量比和不同乳化剂质量分数的乳液流变学性能。所有测试均在25 ℃条件下进行，测试条件为：频率1 Hz，应变范围0.01%～100%，进行全应变扫描；选取适当应变值，设置角频率范围为1～100 rad/s，进行频率扫描；设置剪切速率范围为0.1～100 s-1，进行稳态扫描。对黏度曲线进行Herschel-Bulkley模型拟合，公式如下：

τ=τ0+Kγn。

(2)

式中:τ为剪切应力；τ0为屈服应力；K为稠度系数；γ为剪切速率；n为流动因子。

按如下公式计算得到复合黏度与角频率之间的关系：

(3)

式中:h*为复合黏度；G′为储能模量；G″为损失模量；ω为角频率。

1.7 环境因素对乳液的影响测定

选取明胶/阿拉伯胶质量比为5、乳化剂质量分数为1.5%的样品用于研究环境因素对乳液的影响。首先，研究温度对乳液的影响，将乳液样品分别在25 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃条件下水浴加热2 h，取出后观察样品的显微形貌，并测定AXT含量；其次，将AXT乳液和AXT溶液(油相对照)在紫外条件下照射41 h，于不同时间段(0 h、18 h、29 h、41 h)测定样品的AXT含量；最后，将AXT乳液和AXT溶液(油相对照)在27 ℃条件下避光保存，于不同天数(0 d、5 d、10 d、20 d)测定样品的AXT含量。AXT保留率(R)按如下公式进行计算：

(4)

式中:Ct为处理后测得的AXT总浓度；C0为初始样品中的AXT总浓度。

1.8 生物可及性测定

生物可及性研究参照Zhang等[15]的方法。模拟胃液消化：将HCl、NaCl溶于超纯水中，取15 mL上述溶液加入AXT样品，得到样品混合盐溶液。将胃蛋白酶与15 mL磷酸缓冲液(10 mmol/L，pH=7)混合，加入样品混合盐溶液中，调节体系pH值至2.5，37 ℃水浴搅拌1 h。控制体系中胃蛋白酶的最终质量浓度为3.2 g/L，HCl的最终物质的量浓度为84 mmol/L，NaCl的最终质量浓度为2 g/L。AXT乳液取0.1 g，AXT溶液(油相对照)取与AXT乳液同等AXT当量的质量。

模拟肠液消化：将CaCl2、NaCl溶于超纯水中得到CaCl2-NaCl混合盐溶液。进行模拟肠液消化时，胆盐溶液和胰酶悬浮液用磷酸缓冲液(10 mmol/L，pH=7)新鲜配制。取模拟胃液消化后的样品调节pH至7，加入1.5 mL CaCl2-NaCl混合盐溶液和2.5 mL胆盐溶液，再次调节pH至7，继续加入3.5 mL胰酶悬浮液，得到模拟肠液。控制体系中CaCl2和NaCl的物质的量浓度分别为5 mmol/L和15 mmol/L，胆盐溶液和胰酶悬浮液的质量浓度分别为5 mg/mL和1.6 mg/mL。

将模拟胃、肠液消化后的样品在9 500 r/min、25 ℃条件下离心30 min，取上清液(胶束)。按照测定AXT含量的方法测定离心前后样品中的AXT含量，按如下公式计算样品的生物可及性(B)：

(5)

式中:Cmicelle代表胶束中的AXT浓度；Cdigestion代表胃肠消化液中的AXT浓度。

1.9 数据分析

所有实验数据均以平均值±标准差的形式表示，采用Origin软件进行数据处理，采用SPSS软件进行差异显著性分析，P<0.05认为差异显著。

2 结果与分析

2.1 乳液的微观形貌及稳定性

图1为不同明胶/阿拉伯胶质量比乳液的光学显微照片。包埋AXT的乳液整体呈红褐色，无分层现象，显微形貌为鲜红色球状液滴，外部连续相中无AXT晶体析出，表明负载AXT的乳液体系较为稳定，AXT被包埋于内分散相中。由表1中的乳液粒径结果可以看出，乳液平均粒径随明胶/阿拉伯胶质量比的增加而减小，平均粒径从3.84 μm减小到2.69 μm。当明胶/阿拉伯胶质量比为5和10时，粒径尺寸较为均一，乳液体系较为稳定。因此，选取明胶/阿拉伯胶质量比为5的样品用于进一步探究明胶-阿拉伯胶复合乳化剂的含量对乳液粒径和稳定性的影响。

图1 不同明胶/阿拉伯胶质量比乳液的光学显微照片Fig.1 The optical micrographs of emulsions with different mass ratios of gelatin/arabic gum注：网络版为彩图。

表1 不同明胶/阿拉伯胶质量比乳液的平均粒径Tab.1 The average particle sizes of emulsions with different mass ratios of gelatin/arabic gum

图2为不同乳化剂质量分数乳液的光学显微照片。随着乳化剂质量分数的增加，乳液粒径逐渐减小，平均粒径从4.11 μm减小至1.71 μm(表2)。这是由于明胶具有更好的乳化性，更有利于稳定油水界面，随着乳化剂质量分数的增加，液滴界面的蛋白覆盖量增加，可以稳定更多小液滴，且乳液液滴在高速剪切时聚结的概率减小，形成的乳液粒径更小且均一[16]。

图2 不同乳化剂质量分数乳液的光学显微照片Fig.2 The optical micrographs of emulsions with different mass fractions of emulsifier注：网络版为彩图。

表2 不同乳化剂质量分数乳液的平均粒径Tab.2 The average particle sizes of emulsions with different mass fractions of emulsifier

图3中的乳液稳定性测试结果表明，不同乳化剂质量分数乳液的稳定性指数均小于1，说明乳液都较为稳定。乳液样品的稳定性指数随时间延长呈现出先增加后平缓的趋势。在12 h内，随着乳化剂质量分数从1%增加至3%，乳液稳定性先增加后降低。当乳化剂质量分数为2%时，乳液稳定性指数最小，表明其在储存12 h后最稳定。因此，当明胶/阿拉伯胶质量比为5、乳化剂质量分数为2%时，乳液粒径较小且均一，稳定性最佳。

2.2 乳液的流变学性能

图4a、4b分别为不同明胶/阿拉伯胶质量比和不同乳化剂质量分数乳液的黏度测定结果。在0.1～100 s-1剪切速率范围内，所有乳液样品的黏度均随着剪切速率的增加而降低，呈现出典型的假塑性流体剪切变稀的特点。这是由于剪切速率增加使缠结的聚合物网络结构被打乱，分子间缠结的恢复速率比破坏速率慢，乳液在较高剪切速率下流动的分子间阻力较小[17]。此外，乳液黏度随明胶/阿拉伯胶质量比的增加而降低，这是由于随着明胶/阿拉伯胶质量比的增加，乳化剂中阿拉伯胶的浓度降低，而阿拉伯胶作为一种高分子增稠剂，对体系黏度的维持能力显著高于明胶。乳液黏度的显著增加也伴随着乳化剂质量分数的增加。

图4c、4d分别为不同明胶/阿拉伯胶质量比和不同乳化剂质量分数乳液的复合黏度测定结果。在1～100 rad/s角频率范围内，所有乳液样品的复合黏度均随着角频率的增加而降低。乳液的初始复合黏度随体系中阿拉伯胶含量和乳化剂含量的增加而增加。该复合黏度变化结果与黏度变化结果一致。

表3中的Herschel-Bulkley模型拟合结果表明，屈服应力(τ0)和K值均随着乳化剂质量分数的增加而增加，表明随着乳化剂质量分数的增加，乳液黏度增加。所有乳液样品的流动因子(n)均小于0.5，且随乳化剂质量分数的增加而降低。n值反映了乳液的假塑性程度，n值越小乳液的流动性越差，n=1时乳液为牛顿流体，n<1时乳液为假塑性流体。因此，不同乳化剂质量分数的乳液均为假塑性流体，具有剪切变稀的行为；随着乳化剂质量分数的增加，乳液黏度增加，流动性变差，呈现出类凝胶结构。

图4 乳液的流变学性能Fig.4 The rheological properties of emulsions注：网络版为彩图。

表3 乳液的Herschel-Bulkley模型拟合结果Tab.3 Herschel-Bulkley model fitting results of emulsions

2.3 环境因素对乳液的影响

将乳液分别于25、80、90、100 ℃条件下加热2 h，乳液的光学显微照片如图5所示。随着加热温度的升高，乳液发生破乳，出现热聚集现象，乳液粒径明显增加。当加热温度从25 ℃升高至100 ℃时，乳液平均粒径从2.50 μm增加至3.99 μm，粒径分布不均一(表4)。这是吸附蛋白热变性使得乳液乳化性减弱所致[18]。当液滴表面的吸附蛋白发生热变性时，会暴露其非极性巯基，增加蛋白质分子间的相互作用，引发液滴聚集[19]。液滴聚集后，也较易出现聚并现象，因此在温度升高后，乳液粒径明显增大。乳液在80 ℃和90 ℃条件下的AXT降解率分别为2.2%和5.5%(表4)，说明包埋后的AXT乳液具有优良的热稳定性。

图5 不同加热温度下乳液的光学显微照片Fig.5 The optical micrographs of emulsions under different heating temperatures注：网络版为彩图。

表4 不同加热温度下乳液的平均粒径及AXT保留率Tab.4 The average particle sizes and AXT retention rates of emulsions under different heating temperatures

将未包埋AXT溶液(油相对照)和包埋AXT乳液分别置于紫外灯下照射，测定不同照射时间样品的AXT含量，结果如图6a所示。在紫外照射时间内，包埋AXT乳液的AXT保留率均大于未包埋AXT溶液，这可能是因为乳化包埋后的乳液液滴能够散射光波，有害光波难以进入乳液内部，从而使包埋AXT乳液具有更好的光稳定性[20]。

图6 包埋AXT乳液和未包埋AXT溶液(对照)的AXT保留率Fig.6 AXT retention rates of encapsulated AXT emulsion and unencapsulated AXT solution(control)

AXT的特殊结构使其对环境因素较为敏感，容易在储存过程中受到异构化的影响[21]。将样品在避光环境中储存20 d，测定不同储存时间样品的AXT含量，结果如图6b所示。贮存过程中所有样品的AXT保留率均有所下降；贮存20 d后，包埋乳液中的AXT保留率为83%，比未包埋AXT溶液高5%。这是因为包埋后AXT表面形成有蛋白-多糖界面膜层，能够减弱外界环境对AXT的影响。此外，上述包埋乳液的AXT保留率优于已报道的AXT包埋体系。Zhang等以微球形式包埋AXT，所得AXT微球在25 ℃条件下储存14 d后，AXT保留率仅为50.4%[22]。Zhao等通过乳化-喷干方式包埋AXT油树脂，样品在储存10 d后的AXT保留率为79%左右[23]。

2.4 AXT的生物可及性

疏水性营养素的生物可及性主要取决于物理化学和生物化学的反应过程，包括在食物中的释放、胃肠道液体中的溶解、化学或生化反应的转化以及肠道上皮细胞的吸收等[24-26]。AXT的疏水性较强，而肠上皮细胞顶端表面的渗透性较差，使得AXT的生物可及性较差[27]。基于此，本研究探究了乳液包埋对AXT生物可及性的影响，结果如图7所示。乳化剂质量分数为1%、1.5%、2%、3%乳液的AXT生物可及性分别为81.5%、84.7%、83.4%、86.0%，相互之间无显著性差异；而未包埋AXT溶液(对照)的AXT生物可及性仅为43%，远低于包埋乳液的AXT生物可及性。这是由于乳化包埋提升了AXT在水溶液中的溶解性，相较于对照组，被包埋的AXT经消化后能够有效溶解在混合胶束中，从而增加了其生物可及性。

图7 乳液的AXT生物可及性Fig.7 The AXT bioaccessibility of emulsions注：不同字母代表组间差异显著。

3 结论

本研究采用DES溶解AXT作为油相、以蛋白-多糖混合体系作为乳化剂，制备AXT乳液，探究水相中明胶/阿拉伯胶质量比、乳化剂质量分数对AXT乳液的影响及乳化包埋对AXT特性的影响。明胶/阿拉伯胶质量比和乳化剂质量分数的增加均使得乳液粒径减小，所制备的AXT乳液稳定性良好，表现出剪切变稀特性，且具有类凝胶行为。与未包埋的AXT溶液相比，储存20 d后包埋乳液的AXT保留率增加5%，为83%。包埋乳液的AXT生物可及性为83%，比未包埋AXT溶液提升37%左右。所构建的包埋体系采用食品级原料，安全性高，制备简便，成本低廉，AXT在DES中的溶解度相对传统溶剂较高。本包埋体系的构建以DES作为新型绿色溶剂，为AXT的溶解与包埋提供了新策略，拓宽了AXT在水性基质中的应用。