羊多杀性巴氏杆菌与布鲁氏菌双重套式PCR检测方法的建立及应用

吴昊天，满初日嘎*，刘 昂，何美荣，侯思梦，李崇瑞，杜 丽，陈巧玲，陈 思，王凤阳，李 昌，金宁一

(1.海南大学动物科技学院，海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室，海口市动物基因工程重点实验室，海南海口 570228；2.军事医学研究院军事兽医研究所,吉林长春 130122)

多杀性巴氏杆菌是巴氏杆菌科巴氏杆菌属的革兰氏阴性短杆或者球杆菌，为本属中最广泛引起畜禽疾病的细菌。本菌具有广泛宿主性，可以感染包括羊、牛、猪、兔以及鸡等多种家禽家畜，主要造成呼吸道系统损伤以及败血症。目前多杀性巴氏杆菌的的检测方法除了传统的细菌培养以外，还有PCR、LAMP[1]、RPA与RAA[2]等核酸检测手段。

布鲁氏菌是布鲁氏菌属的马尔他(羊种)布鲁氏菌、流产(牛种)布鲁氏菌、猪布鲁氏菌、绵羊布鲁氏菌、沙林鼠布鲁氏菌和犬布鲁氏菌的统称[3]，可以引起人和多种动物疾病。已经建立的分子生物学的诊断方法除了传统的PCR以外，还有ddPCR[4]、qPCR[5]、RPA-LFD[6]等多种方法。

套式PCR是使用内外两对引物对目的DNA片段进行两轮扩增的技术，第一轮扩增使用外侧引物对全长进行扩增，第二轮使用内侧引物对全长内较短的片段进行扩增。该方法拥有高灵敏度，高特异性的优点。目前使用双重套式PCR同时对多杀性巴氏杆菌和布鲁氏菌这两种羊常见的细菌的检测方法还未见报道。本研究建立了一种快捷、准确和高灵敏度的双重套式PCR，以期能够在多种样本中检测这两种病原菌。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病原及细菌 多杀性巴氏杆菌、海藻糖巴氏杆菌、猪链球菌、鲍曼不动杆菌、斯氏假单胞菌均由本实验室分离，布鲁氏菌S2株购自金宇保灵生物药品有限公司，大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌均购自国家微生物资源平台。

1.1.2 样本来源 3份布鲁氏菌阳性样本来自于本实验保存的绵羊攻毒布鲁氏菌S2株后的下颌淋巴结样本，3份多杀性巴氏杆菌阳性样本来自于本实验室保存的山羊攻毒多杀性巴氏杆菌后的肝脏样本，3份阴性样本来自于本实验室保存的健康山羊组织样本。

1.1.3 主要试剂 2×TaqPlus Master MixⅡ，中国南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品；DNA Marker B，中国上海生工生物工程股份有限公司产品；琼脂糖，德国Biofroxx公司产品；细菌基因组提取试剂盒、质粒少量提取试剂盒、血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、pGM-T连接试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，均为北京天根生化科技有限公司产品；胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)，均为北京青岛海博生物技术有限公司产品；LB培养基由本实验室配制。

1.1.4 主要仪器 PCR仪(Biometra TOne 96G)，德国Biometra公司产品；超微量分光光度计(NanoPhotometer N50)，德国IMPLEN公司产品；凝胶成像系统(ChampChemi 610)，北京赛智创业科技有限公司产品；电泳仪(DYY-12)，北京六一生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计合成 根据NCBI数据库中公布的多杀性巴氏杆菌kmt1基因序列和布鲁氏菌BCSP31基因序列，使用Primer primer5软件针对每个基因各设计了1对标准品引物、1对外引物和1对内引物。其中外引物产物在标准品引物产物内侧，内引物产物在外引物产物内侧。序列见表1。

1.2.2 细菌 DNA模板制备 分别将多杀性巴氏杆菌、海藻糖巴氏杆菌、猪链球菌、鲍曼不动杆菌、斯氏假单胞菌、布鲁氏菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌划线接种于TSA平板。37℃培养24 h后，挑取单菌落接种于5 mL TSB培养基。37℃振荡培养18 h后，取4 mL菌液分别按照天根细菌基因组提取试剂盒说明书提取细菌基因组。

1.2.3 样本DNA模板制备 所有冻存的样品均按照天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书提取样品内的山羊与细菌的总DNA。

表1 引物序列

1.2.4 标准品质粒构建 使用标准品引物，分别以多杀性巴氏杆菌基因组或布鲁氏菌基因组为模板进行PCR，反应体系为50 μL，包括2×TaqPlus Master MixⅡ25 μL、kmt1-STF/BCSP31-STF(10 μL/L)与kmt1-STR/BCSP31-STR(10 μL/L)各1 μL、模板2 μL，用ddH2O补至50 μL。反应条件为95℃ 3 min；95℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 45 s，共30个循环；72℃延伸3 min。

PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后，按照天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书回收目的条带。使用pGM-T连接试剂盒将回收的目的条带与pGM-T载体连接，构建重组质粒。将质粒转化至大肠埃希氏菌感受态DH5α，挑取阳性菌落至液体LB培养基中，37℃振荡培养12 h后，按照天根质粒少量提取试剂盒提取重组质粒DNA并测序。

1.2.5 双重套式PCR反应体系建立 以多杀性巴氏杆菌和布鲁氏菌基因组为第一轮反应的模板，建立多杀性巴氏杆菌与布鲁氏菌双重套式PCR体系。第一轮反应体系为20 μL，包括2×TaqPlus Master MixⅡ10 μL、kmt1-outF(10 μL/L)，kmt1-outR(10 μL/L)，BCSP31-outF(10 μL/L)与BCSP31-outR(10 μL/L)各0.5 μL、模板1 μL，用ddH2O补至20 μL。反应条件为：95℃ 3 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共25个循环；72℃延伸3 min。

第一轮反应产物稀释100倍后作为第二轮反应的模板。第二轮反应体系为20 μL，包括2×TaqPlus Master MixⅡ10 μL、kmt1-inF(10 μL/L)，kmt1-inR(10 μL/L)，BCSP31-inF(10 μL/L)与BCSP31-inR(10 μL/L)各0.5 μL、模板1 μL，用ddH2O补至20 μL。反应条件为：95℃ 3 min；95℃ 30 s，61℃ 30 s，72℃ 20 s，共25个循环；72℃延伸3 min。产物用20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.6 双重套式PCR特异性测定 分别以沙门氏菌、猪链球菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、海藻糖巴氏杆菌和斯氏假单胞菌基因组为模板进行双重套式PCR，产物用20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.7 双重套式PCR灵敏度检测 测定标准品质粒的浓度，并计算其拷贝数。将已知拷贝数的标准品梯度稀释后作为反应模板分别进行双重套式PCR和普通PCR，产物用20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

普通PCR的体系与条件除使用标准品质粒为模板以外，其余均与第二轮套式PCR相同。

1.2.8 双重套式PCR检测病料 以多杀性巴氏杆菌阳性病料和布鲁氏菌阳性病料提取的DNA为模板，用双重套式PCR进行检测。

2 结果与分析

2.1 双重套式PCR反应体系建立

成功建立双重套式PCR反应，使用目标细菌基因组为模板，两轮反应均无非特异性条带产生，且条带清晰(图1)。

A.第一轮扩增：M.Maker；1.空白对照；2.多杀性巴氏杆菌和布鲁氏菌；3.布鲁氏菌；4.多杀性巴氏杆菌

2.2 双重套式PCR的特异性

使用沙门氏菌、猪链球菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、海藻糖巴氏杆菌和斯氏假单胞菌八种常见细菌或者羊源细菌的基因组作为模板进行检测，结果表明该方法特异性良好，无非特异性条带扩增(图2)。

M.Maker；1.沙门氏菌；2.猪链球菌；3.大肠埃希氏菌；4.金黄色葡萄球菌；5.铜绿假单胞菌；6.鲍曼不动杆菌；7.海藻糖巴氏杆菌；8.斯氏假单胞菌

2.3 双重套式PCR的灵敏度

以梯度稀释的标准品质粒为模板，分别对其用双重巢式PCR和普通PCR的方法进行检测，结果表明，双重套式PCR具有极佳的灵敏度，可达到普通PCR的100倍～1 000倍，对于kmt1最低可检测70.9 copies/μL，对于BCSP31最低可检测89.5 copies/μL。(图3、4)。

A.双重套式PCR：M.Maker；1～10.7.09×107 copies/μL～7.09×10-2 copies/μL；11.空白对照 B.普通PCR：M.Maker；1～10.7.09×107 copies/μL～7.09×10-2 copies/μL；11.空白对照A.Double nested PCR:M.Maker; 1-10.7.09×107 copies/μL-7.09×10-2 copies/μL; 11.Negative control B.Normal PCR:M.Maker; 1-10.7.09×107 copies/μL-7.09×10-2 copies/μL; 11.Negative control

A.双重套式PCR：M.Maker；1～10.8.95×107 copies/μL～8.95×10-2 copies/μL；11.空白对照B.普通PCR：M.Maker；1～10.8.95×107 copies/μL～8.95×10-2 copies/μL；11.空白对照A.Double nested PCR:M.Maker; 1-10.8.95×107 copies/μL-8.95×10-2 copies/μL; 11.Negative controlB.Normal PCR:M-Maker; 1-10.8.95×107 copies/μL-8.95×10-2 copies/μL; 11.Negative control

2.4 双重套式PCR检测病料

以从多杀性巴氏杆菌或布氏杆菌S2株攻毒后的羊组织样本提取的总DNA为模板，用双重套式PCR进行检测。结果表明，双重套式PCR可以准确在组织样本的总DNA中检测到病原DNA(图5)。

A.检测感染多杀性巴氏杆菌病料：M.Maker；1～3.3份感染多杀性巴氏杆菌病料；4～6.3份阴性样本

3 讨论

病原微生物的检测不仅是传染病诊断的主要工具之一，对于各类传染病的防控也有着重要的意义。最传统的病原检测方式为对样本进行细菌培养，然后挑取可疑菌落进行鉴定，但该方法检测速度慢，人工成本高，不适用于大规模使用。血清学方法如凝集试验和ELISA虽然速度快，但是灵敏度较差，且其中针对抗体的检测方不适用于接种过疫苗的动物。以PCR为代表的核酸检测方法正在不断推广到临床。这类技术的优势在于灵敏度高、特异性强，检测速度快[7]。多重套式PCR是将多重PCR和套式PCR结合起来的PCR技术，不但可以同时对多个病原进行高灵敏度高特异性的检测，而且相比于普通的PCR，同时提高了灵敏度和特异性[8]。王多智[9]等人使用套式PCR检测绵羊梅迪-维斯纳病，灵敏度可达到普通PCR的10倍。孙明[10]等建立的牛巴贝斯虫套式PCR检测方法的灵敏度能达到普通PCR的1 000倍。目前套式PCR在兽医上的应用还不广泛，王朋林等[11]建立了猪囊孢球虫和毕氏肠微孢子虫的双重套式PCR方法，张静[12]等建立了猪圆环病毒3型套式PCR检测方法。

多杀性巴氏杆菌病和布鲁氏菌病都是羊常见的细菌性疾病。多杀性巴氏杆菌可引起包括羊、牛、猪、禽类等多种动物的疾病，还可以通过动物抓咬、皮肤损伤等感染人类[13]。本菌可引起羊出血性败血症，常导致幼羊胸腔和肝脏病变，病死率高，传播速度快[14]。多杀性巴氏杆菌能在健康动物的呼吸道黏膜生存，因此在成年羊多为隐性感染[15]。布鲁氏菌主要侵染羊的生殖系统，具有较长的潜伏期。被感染的公羊表现为睾丸炎，母羊会表现为流产和子宫内膜炎等症状，并会随着分娩或者流产大量排出细菌[16]。布鲁氏菌可以通过直接接触、消化道误食和呼吸道吸入感染人类[17]。这两种细菌均容易随着无症状的动物传播，且对动物和人员都具有一定的危害性。为了保证动物与畜牧从业人员的健康，防止这两种细菌的传播，需要建立一种高灵敏度、高特异性的检测方法来对这两种细菌进行筛查。

本研究建立了一种可以同时对多杀性巴氏杆菌和布鲁氏菌进行检测的高灵敏度和特异性的方法。试验显示，本方法具有良好的特异性，对于多种常见或者羊源的细菌均无非特异性扩增。本方法具有极高的灵敏性，最低可以检测70.9 copies/μL的kmt1基因或者89.5 copies/μL的BCSP31基因，灵敏度可达普通PCR的100倍。此外，本方法能够准确地在人工感染动物的不同器官组织样本中检测到对应的细菌，并且不会对阴性样本有非特异性扩增。使用本方法可以在3 h内一次检测两种病原核酸，并且由于高特异性和灵敏度，可以适应多种来源的样本，且无需对样本DNA进行额外的富集。相比于多重qPCR、多重RPA、多重LAMP等检测手段，多重套式PCR成本低廉，操作简便，在畜群净化、动物检疫、疾病诊断等领域有着广阔的应用前景。